豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)流行于世界各國(guó)豬群中,主要與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫(CT)以及豬繁殖系統(tǒng)障礙等多種疾病密切相關(guān),這些疾病被統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVD),嚴(yán)重影響著世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前,已知的豬圓環(huán)病毒包括三種,豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、2型(PCV2)和3型(PCV3)。其中,PCV2核衣殼蛋白Cap含有抗原中和表位,可產(chǎn)生針對(duì)PCV2的特異性抗體,是PCV2亞單位疫苗和血清診斷的主要目標(biāo)蛋白,被大量應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。PCV2的抗體檢測(cè)方法主要有ELISA、IPMA和IFA等,其中ELISA抗體檢測(cè)方法具備操作簡(jiǎn)便,可同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn),得到科研機(jī)構(gòu)和養(yǎng)殖場(chǎng)的普遍應(yīng)用。本研究基于CHO-K1真核表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建重組質(zhì)粒pEE12.4-PCV2-Cap,轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,通過(guò)加壓篩選,有限稀釋,得到能夠高效表達(dá)Cap蛋白的單克隆細(xì)胞株,并對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行懸浮馴化、發(fā)酵、純化,得到目的蛋白通過(guò)Western blot以及動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其免疫原性。結(jié)果表明PCV2-Cap蛋白能夠在CHO-K1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá);發(fā)酵過(guò)程中活細(xì)胞密度高達(dá)6.0×10~6個(gè)/mL,細(xì)胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表達(dá)量約為370 mg/L;并通過(guò)Western blot驗(yàn)證和間接ELISA檢測(cè)方法的建立,證明了該蛋白具備良好的免疫原性。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)PCV2-Cap蛋白的CHO-K1懸浮穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并初步建立了間接ELISA檢測(cè)方法,為豬圓環(huán)病毒2型血清學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 2.1 Cap 目的片段 PCR 擴(kuò)增.2.1Amplification of Cap target fragment. DL2000 Marker；1-2. Cap 目的片段；er；1-2. Production of Cap gene by PCR機(jī)挑取 12 個(gè)單菌落做菌液 PCR 鑒，為陽(yáng)性克隆，如圖 2.2 所示。

圖 2.2 重組質(zhì)粒菌液 PCR 鑒定Fig.2.2 PCR identification of bacterial solutionM. DL5000 Marker；1-12. 單菌落 PCR 結(jié)果；13.陰性對(duì)照M. DL5 000 Marker；1-12. PCR results of the single colonies；13. Negative control重組質(zhì)粒經(jīng) HindIII 和 EcoRI 雙酶切后，電泳顯示兩條帶，分別為 pEE1載體（8262 bp）和目的條帶（660 bp），與預(yù)期大小一致，如圖 2.3 所示。測(cè)結(jié)果顯示 Cap 基因序列正確。

圖 2.2 重組質(zhì)粒菌液 PCR 鑒定Fig.2.2 PCR identification of bacterial solution000 Marker；1-12. 單菌落 PCR 結(jié)果；13.陰性對(duì)照r；1-12. PCR results of the single colonies；13. NegI 和 EcoRI 雙酶切后，電泳顯示兩條帶，分條帶（660 bp），與預(yù)期大小一致，如圖 2正確。
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