口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV)感染偶蹄動物引起的一種高度接觸性傳染病,可感染牛、羊和豬等70多種動物。FMDV主要通過呼吸道和消化道黏膜侵入機體,對動物的健康、生長、動物及動物產品的全球貿易造成了嚴重影響,目前仍無安全高效的疫苗用于本病的預防。肥大細胞和巨噬細胞是天然免疫系統(tǒng)的重要免疫細胞,主要分布于皮膚和粘膜中,與樹突狀細胞共同構成抗感染的第一道防線,可通過其表面的模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別細胞內外病原及病原相關產物,作為效應細胞以吞噬或非吞噬途徑殺死病原體,在抗感染過程中發(fā)揮重要作用,因此被稱為機體的“哨位細胞”。肥大細胞通過PRRs識別病原體,可引起脫顆粒釋放多種活性物質,改變血管通透性、啟動炎癥反應,并調節(jié)其他細胞功能,但目前對肥大細胞在抗FMDV感染中的作用了解甚少。清道夫受體(scavenger receptor,SR)是巨噬細胞等表達的吞噬受體和PRRs,可識別多種病毒和細菌,引起巨噬細胞活化,分泌TNF-α、IL-6與IFN-γ等。本實驗室研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞可通過SR識別重組FMDV VP1-VP4,SR在樹突狀細胞提呈FMDV VP1-VP4抗原中發(fā)揮負調節(jié)作用,但對SR介導巨噬細胞抗FMDV的免疫應答作用尚不清楚。本研究用口蹄疫病毒樣顆粒(FMDV virus-like particles,FMDV-VLPs)分別負載小鼠腹腔肥大細胞(peritoneal mast cells,pMCs)和脫顆粒抑制劑丹參酮ⅡA預處理的pMCs,以不做處理的pMCs為對照組,培養(yǎng)6 h收集各組pMCs及其上清液,分別作用于脾初始淋巴細胞,以單純脾初始淋巴細胞為對照組,同時每個組均設刀豆蛋白A處理的對照組,用CCK-8試劑盒檢測淋巴細胞增殖,并對各組pMCs進行甲苯胺藍染色,觀察脫顆�，F(xiàn)象。結果顯示,負載FMDV-VLPs的pMCs組未脫顆粒的pMCs數(shù)量極顯著低于單純pMCs組(P0.01)和丹參酮ⅡA預處理組(P0.01),這說明FMDV-VLPs刺激pMCs可引起明顯的脫顆粒。負載FMDV-VLPs的pMCs上清液對脾總淋巴細胞的增殖具有一定的促進作用。丹參酮ⅡA可抑制FMDV-VLPs誘導的pMCs脫顆粒,并降低pMCs上清液促進淋巴細胞增殖的作用,但FMDV-VLPs刺激pMCs后的上清液對脾T淋巴細胞增殖具有明顯的抑制作用,丹參酮ⅡA處理組pMCs的上清液使脾T淋巴細胞增殖進一步降低。這表明,在肥大細胞不與淋巴細胞接觸和無抗原存在的條件下,FMDV-VLPs誘導的pMCs脫顆粒產物具有促進脾初始淋巴細胞增殖的作用,而其分泌成分則對脾T淋巴細胞增殖發(fā)揮抑制作用。用FMDV-VLPs分別負載小鼠腹腔巨噬細胞(peritoneal macrophages,pMΦ)、以及紫草素和番瀉苷B同時預處理的pMΦ,以不做處理的pMΦ為對照組,培養(yǎng)6h收集各組上清液,分別作用于脾初始淋巴細胞,以單純脾初始淋巴細胞、FMDV-VLPs處理的脾初始淋巴細胞、負載FMDV-VLPs的pMΦ-脾初始淋巴細胞為對照組,同時每個組均設刀豆蛋白A預處理的對照組,用CCK-8試劑盒檢測淋巴細胞增殖。結果顯示,FMDV-VLPs可直接促進脾總淋巴細胞增殖(P0.01),但不能直接促進T淋巴細胞增殖;負載FMDV-VLPs的pMΦ可極顯著促進脾總淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖(P0.01),而且FMDV-VLPs通過pMΦ的提呈作用促進脾淋巴細胞增殖的作用強于其直接刺激脾淋巴細胞增殖的作用;但負載FMDV-VLPs的pMΦ上清液不能促進脾總淋巴細胞和T淋巴細胞增殖作用,而且單純pMΦ上清液也不能促進脾總淋巴細胞和T淋巴細胞增殖作用。這表明,B淋巴細胞可通過B細胞受體直接特異性識別FMDV-VLPs啟動活化與增殖,而不需要抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)的加工和處理,同時B淋巴細胞的活化需要抗原信號與共刺激信號的同時存在。盡管FMDV-VLPs刺激可引起pMCs和pMΦ分泌多種蛋白質分子(如G-CSF、IL-13、IL-15、IL-17、IL-17BR等),但與pMCs相比,負載FMDV-VLPs的pMΦ只有與淋巴細胞接觸才能將其激活。值得注意的是,可抑制TNF-αmRNA成熟的紫草素和可抑制SR的番瀉苷B預處理后負載FMDV-VLPs的pMΦ上清液對脾總淋巴細胞和T淋巴細胞均發(fā)揮極顯著的抑制作用(P0.01),這表明巨噬細胞分泌的TNF-α和SR所介導的生物學作用對脾臟免疫應答的建立具有促進作用。用FMDV-VLPs分別負載單純pMΦ、以及NF-κB抑制劑漢黃芩素和SR抑制劑番瀉苷B預處理后的pMΦ,以分別負載OVA或重組FMDV蛋白VP1-VP4的pMΦ為對照組,同時以不做處理的pMΦ為空白組。培養(yǎng)4 h分別收集各組pMΦ,用染色質免疫共沉淀法(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)檢測NF-κB與TNF-α啟動子的結合活性。用兔抗小鼠NF-κB1 p105/p50抗體進行ChIP,與無關抗原的兔IgG進行ChIP比較,所捕獲的TNF-α啟動子片段的%Input值差異極顯著,其中pMΦ組所捕獲的TNF-α啟動子片段的%Input值升高3.28倍(P0.001),OVA組升高11.27倍(P0.001),VP1-VP4組升高14.54倍(P0.001),FMDV-VLPs組升高4.65倍(P0.001),抑制劑處理組升高3.53倍(P0.001)。而比較各組用兔抗小鼠NF-κB1p105/p50抗體沉淀的NF-κB水平發(fā)現(xiàn),單純pMΦ組極顯著低于OVA組(P0.001)和VP1-VP4組(P0.001),顯著低于FMDV-VLPs組(P0.05)。OVA組極顯著高于FMDV-VLPs組(P0.01)和抑制劑處理組(P0.001)。VP1-VP4組顯著高于FMDV-VLPs組(P0.05),極顯著高于抑制劑處理組(P0.001)。結果表明,兔抗小鼠NF-κB1 p105/p50抗體可與NF-κB-TNF-α啟動子復合物特異性結合,FMDV-VLPs和FMDV VP1-VP4均能刺激NF-κB活化進核并結合TNF-α啟動子。VP1-VP4組NF-κB與TNF-α啟動子的結合活性最高,其次是OVA和FMDV-VLPs。用VP1-VP4作為FMD疫苗抗原可能會加劇接種動物注射部位的組織炎癥,而FMDV-VLPs可緩解接種動物注射部位的組織炎癥。漢黃芩素通過抑制NF-κB與TNF-α啟動子的結合活性降低TNF-α的表達,可抑制疫苗注射部位的炎癥,減輕疫苗接種動物的痛苦。以上結果表明,肥大細胞可識別FMDV-VLPs,且能被刺激活化引起明顯的脫顆粒。同時,被FMDV-VLPs活化的pMCs分泌的顆粒成分可促進脾總初始淋巴細胞增殖,而其分泌成分則抑制初始T淋巴細胞增殖。巨噬細胞也能識別FMDV-VLPs,并可通過抗原提呈作用啟動淋巴細胞增殖,但需巨噬細胞與淋巴細胞直接接觸;巨噬細胞分泌的TNF-α和其表面的SR所介導的生物學作用對脾臟免疫應答的建立具有促進作用。FMDV-VLPs和FMDV VP1-VP4刺激均可顯著提高巨噬細胞NF-κB與TNF-α啟動子的結合活性,但VP1-VP4刺激活化NF-κB與TNF-α啟動子結合的作用強于FMDV-VLPs,這表明VP1-VP4刺激TNF-α產生的作用較強,可能會引起注射部位的炎癥反應,而FMDV-VLPs較弱,不會引起炎癥反應,可減輕接種疫苗的痛苦。漢黃芩素可通過抑制NF-κB的結合活性降低TNF-α,緩解疫苗注射部位的炎癥,減輕疫苗接種動物的痛苦,故可用作口蹄疫疫苗的佐劑成分。
【學位單位】：河北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

口蹄疫（food-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus, FMDV）感染豬、牛、羊等偶蹄動物引起的一種高度接觸性傳染病。易感動物主要包括豬、牛、綿羊、山羊、水牛、駱駝等 70 多種動物，其中牛最為易感�；疾游锏闹饕l(fā)病特點是發(fā)熱，并在口腔黏膜、舌面、鼻鏡、蹄部和乳房等部位發(fā)生水泡和潰爛。因其對全球畜牧業(yè)生產與食品安全造成重大的威脅，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列入 A 類動物傳染病之首。盡管人類發(fā)現(xiàn) FMD 已經有五百多年的歷史，但由于對機體抗 FMDV 感染的免疫學機制缺乏足夠的認識，目前仍無理想的疫苗用于本病預防[1,2]。1.1.1 口蹄疫病毒病原學口蹄疫病毒屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，由長約為8500個核苷酸的單股正鏈RNA基因組和對稱正二十面體的衣殼蛋白組成，外表呈球形，無囊膜。FMDV的衣殼是由結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4構成二十面體的對稱結構（圖1）。四個結構蛋白的各一分子組成一個殼粒，每五個殼粒經一個脲敏感結合區(qū)聚集在一起形成一個五聚體，十二個五聚體借助組氨酸聚合成病毒衣殼，這就決定了病毒在低于pH 7.0的環(huán)境中的不穩(wěn)定性[3,4]。

圖2 2007年至2014年期間FMDV在全球各地區(qū)的爆發(fā)情況Fig. 2 Occurrence of FMDV events between 2007 and 2014[25]1.1.3 口蹄疫疫苗研究進展1937年Waidmann等首次制成了鋁膠甲醛滅活疫苗并用于臨床至今已經82年，人類研制出了多種FMD疫苗，包括滅活疫苗、DNA疫苗、基因工程苗、合成肽疫苗等。目前預防口蹄疫的各類疫苗雖然可誘導高水平的中和抗體，在口蹄疫控制中起著至關重要的作用，但是也依然存在許多問題，包括疫苗抗原的不穩(wěn)定性，純化過程中抗原的喪失，免疫原性低，抗體維持不足以及抗原保護范圍窄等。目前市場上的FMD疫苗大多數(shù)為滅活疫苗，通過用BHK-21細胞培養(yǎng)獲得FMDV活毒，然后經二元乙烯亞胺（BEI）滅活再純化，最后使用適當?shù)淖魟┤缬突驓溲趸X/皂苷配制而成。滅活疫苗的生產需要嚴格的密封生物環(huán)境和昂貴的生物控制設施，在病毒滅活過程中存在病毒逃逸的生物安全隱患，并且出現(xiàn)不完全滅活而導致在接種疫苗的動物中引起FMDV感染[28]；此外，F(xiàn)MD滅活疫苗在動物注射部位容易形成肉芽腫，免疫保護期短，并且在不同血清型FMDV之間沒有交叉保護作用[29,30]；接種滅活疫苗只能降低感染率，但并不能阻止病毒的復制和傳播。研究表明，F(xiàn)MDV可在接種滅活FMD疫苗的動物的上皮表面進行病毒復制，導致接種滅活疫苗的動物持續(xù)感

趨化因子和生長因子[46]（圖3），肥大細胞可通過這些活性物質對周圍的細胞功能進行調節(jié)。圖3 活化的肥大細胞可分泌多種細胞因子、趨化因子和生長因子調節(jié)周圍細胞功能Fig.3 Activated mast cells secrete a variety of cytokines, chemokines, and growth factors to regulate peripheral cellfunction[46]活化的肥大細胞分泌活性物質可直接作用于感染部位的血管和毛細淋巴管從而改變二者通透性，募集中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞等進入感染病灶或引流淋巴結（圖4），而且肥大細胞還可通過分泌TNF-α和CCL20募集激活樹突狀細胞（dendritic cell，DC）并促進抗原提呈[47]。
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本文編號：2841199