腸炎沙門氏菌(Sallmonellaenteritidis,SE)常定植于成年家禽生殖道的卵巢等組織,造成禽蛋的直接污染和垂直傳播難于清除和預(yù)防,不僅影響了產(chǎn)蛋量,還造成禽蛋和環(huán)境污染,危害人類健康。卵巢和輸卵管的抗菌作用對于禽蛋免受感染以及產(chǎn)生衛(wèi)生蛋是必需的,鑒于SE感染鴨生殖道過程中,宿主的應(yīng)答反應(yīng)及關(guān)鍵分子的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究以高產(chǎn)蛋鴨紹鴨為研究對象,構(gòu)建人工感染模型,通過RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng)篩選鴨感染SE的應(yīng)答基因,并探討了關(guān)鍵基因PERP在調(diào)控SE感染鴨卵泡顆粒細(xì)胞(duckgranulosacell,dGC)凋亡中的作用機(jī)制,研究結(jié)果為揭示SE的致病機(jī)理及宿主抗病機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)為提高禽蛋食品安全性提供一定的參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.SE人工感染鴨生殖道的動態(tài)分布及部分免疫指標(biāo)檢測構(gòu)建SE人工感染模型,利用特異性PCR和免疫組化檢測了 SE組織分布,系統(tǒng)監(jiān)測了感染后1-13周的糞便帶菌率。結(jié)果顯示,SE感染鴨大多數(shù)呈隱性感染狀態(tài),致死率不高,但長期間歇性對外排毒,性成熟后細(xì)菌擴(kuò)散至生殖道,并根據(jù)1-13周糞便帶菌率結(jié)合生殖道剖檢病變,將感染鴨分為易感組和不易感組,易感鴨卵巢基質(zhì)、小卵泡、輸卵管峽部和陰道載菌量分別為 5.04 log CFU/g、3.57 log CFU/g、4.92 log CFU/g 和 5.74 log CFU/g。同時(shí),采用ELISA法檢測了 SE感染后鴨血清中免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)和生殖激素(PROG、E2、LH、FSH)水平,結(jié)果表明,易感組鴨IgA、IgG、IgM水平顯著高于不易感組(P0.05),而CD3+、CD4+、CD8+含量呈現(xiàn)出相反趨勢;易感組鴨PROG、E2、LH、FSH水平顯著低于不易感組(P0.05)。進(jìn)一步采用RT-qPCR檢測了感染13周后對細(xì)菌定植組織進(jìn)行免疫應(yīng)答基因表達(dá)譜。結(jié)果表明,SE 感染后,Tolls 樣受體(TLR2、TLR4-5、TLR15、TLR21)、NODs 樣受體(NOD1、NLRX1、NLRP12)、禽類β-防御素(AvβD4-5、AvβD7、AvβD12)、細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β、IFN-γ)和MyD88在卵巢基質(zhì)、小卵泡、輸卵管峽部和陰道等組織顯著上調(diào)(P0.05);而TLR3、TLR7、NLRC3和TNF-α在上述組織中顯著下調(diào)(P0.05)。上述結(jié)果表明,SE感染導(dǎo)致鴨機(jī)體產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外,檢測了 SE感染后鴨產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。結(jié)果顯示,SE感染后,開產(chǎn)推遲,易感組24周產(chǎn)蛋率僅為67.14%,顯著低于不易感組(92.86%)和對照組(98.57%),同時(shí)SE感染后,蛋重、蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度和蛋黃顏色等指標(biāo)顯著下降(P0.05)。由上可以看出,SE感染對蛋鴨產(chǎn)蛋量、蛋品質(zhì)都產(chǎn)生了較大的影響。2.基于RNA-seq篩選SE感染鴨卵巢的應(yīng)答基因?yàn)榻沂绝哠E感染宿主生殖道應(yīng)答機(jī)制,在上述建立鴨SE卵巢感染模型的基礎(chǔ)上,通過RNA-Seq高通量測序技術(shù),分析了 SE感染前后卵巢組織(小卵泡、卵巢基質(zhì))差異表達(dá)基因。結(jié)果表明,小卵泡和卵巢基質(zhì)組織分別篩選出915和1203個(gè)差異基因,其中PERP、EGFR、PAFAH1B2、DOK6、RXFP2等23個(gè)基因?yàn)楣餐町惐磉_(dá)基因,KEGG富集分析表明,差異基因主要富集在細(xì)胞凋亡相關(guān)通路p53信號通路。并采用RT-qPCR驗(yàn)證部分差異基因,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果均一致。該結(jié)果篩選出的鴨卵巢SE感染應(yīng)答基因,為進(jìn)一步研究SE的卵巢致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。3.PERP在SE感染鴨卵泡顆粒細(xì)胞致凋亡作用研究以關(guān)鍵候選應(yīng)答基因PERP為研究對象,以鴨卵泡顆粒細(xì)胞為模型,通過干擾和過表達(dá)手段,分析其在SE感染dGC中的作用。結(jié)果表明,SE感染dGC,經(jīng)PERP過表達(dá)后,p53信號通路關(guān)鍵分子p53、MDM2、PERP以及caspace-3和Bcl-2在mRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào)(P0.01);PERP敲低后,表現(xiàn)出相反趨勢。同時(shí)采用CCK8和FACS分別檢測了過表達(dá)和敲低PERP顆粒細(xì)胞增殖與凋亡水平,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PERP促進(jìn)dGC凋亡,敲低PERP促進(jìn)dGC增殖(P0.01)。進(jìn)一步采用平板計(jì)數(shù)法檢測過表達(dá)和敲低PERP后dGC的SE黏附和侵襲量,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PERP,SE對dGC的黏附和侵襲能力顯著增強(qiáng),而敲低PERP,則減少SE對dGC的黏附和侵襲量(P0.01)。上述結(jié)果提示PERP可介導(dǎo)p53信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控SE感染dGC致凋亡作用。4.PERP蛋白與腸炎沙門氏菌SipC蛋白相互作用為進(jìn)一步揭示PERP蛋白體外參與SE感染dGC的作用,利用Gateway技術(shù),以鴨腸炎沙門氏菌MY1 SipC蛋白(SE感染中的分泌到宿主細(xì)胞的效應(yīng)蛋白)作為“誘餌”,通過GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)從dGC cDNA文庫中篩選到12個(gè)與SipC蛋白相互作用蛋白,其中PERP的陽性克隆出現(xiàn)頻率高、速度快,表明PERP與腸炎沙門氏菌SipC效應(yīng)蛋白發(fā)生互相作用。采用一對一酵母回復(fù)性雜交和GST-pull down試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SipC與PERP相互作用關(guān)系,且利用λRed同源重組系統(tǒng)構(gòu)建sipC基因缺失株,體外證實(shí)過表達(dá)PERP可以促進(jìn)SE MY1 SipC黏附鴨卵泡顆粒細(xì)胞。綜上所述,SE感染后,不僅引起鴨卵巢基質(zhì)、小卵泡、輸卵管峽部和陰道等組織免疫應(yīng)答反應(yīng),還影響產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。感染中關(guān)鍵應(yīng)答基因PERP可介導(dǎo)p53信號傳導(dǎo)途徑參與dGC凋亡,并與SE SipC蛋白相互作用,促進(jìn)細(xì)菌侵襲。本研究結(jié)果為揭示SE的致病機(jī)理及宿主抗病機(jī)制提供參考,也為后續(xù)的抗病分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.32
【部分圖文】：

１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０?２１?２２?２３?２４?２５?２６?２７??Ａｇｅ（ｖｖｋ）??圖１－２試驗(yàn)期間蛋鴨糞便排毒帶菌分析??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ?ｏｆ?ＳＥ－ｐｏｓ

３７°Ｃ培養(yǎng)２４ｈ后再加入９ｍＬ?ＳＣ選擇性增菌液，３７°Ｃ培養(yǎng)２４ｈ后用熱裂解法制備模板。進(jìn)??行擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)易感組鴨的小卵泡、卵巢基質(zhì)、峽部、陰道增菌液較渾濁，擴(kuò)增后出現(xiàn)??預(yù)期的２９３ｂｐ大小的條帶（圖１－５），其他組織未出現(xiàn)條帶；不易感組和對照組所有組織均??未擴(kuò)增出條帶。�。担埃穑痰慕M織勻漿，涂布在ＤＨＬ平板上，３７°Ｃ培養(yǎng)２４ｈ后，與ＰＣＲ檢??測結(jié)果一致，小卵泡、卵巢基質(zhì)、峽部、陰道組織勻漿液出現(xiàn)了單個(gè)菌落。大卵泡、漏斗??部、膨大部、子宮組織勻漿液未出現(xiàn)菌落，通過ＳＥ組織載菌量（ＣＦＵ）評估，卵巢基質(zhì)??中細(xì)菌定植最高

?Ｍｌ?２３４?５?６７８９?１０?１１??圖１－５感染ＳＥ生殖道不同組織增菌液．《仍基因ＰＣＲ鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＥ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 梁向明;;鴨感染腸炎沙門氏菌的診治[J];貴州畜牧獸醫(yī);2010年02期

2 ;腸炎沙門氏菌(SE)與長期健康[J];中國家禽;2000年08期

3 周宗清;腸炎沙門氏菌檢測的最新進(jìn)展[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;1995年04期

4 芮洪福;一飲食連鎖店發(fā)生腸炎沙門氏菌病暴發(fā)[J];江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué);1995年01期

5 胡貴舟;;腸炎沙門氏菌病正在蔓延[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1992年02期

6 田如惠;新生兒腸炎沙門氏菌敗血癥并化腦1例[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;1988年06期

7 黎方連;一起由腸炎沙門氏菌引起的食物中毒[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1989年02期

8 林祖治;容永健;盧妙玲;;腸炎沙門氏菌敗血癥一例報(bào)告[J];廣東衛(wèi)生防疫;1989年04期

9 余波;徐景峨;譚詩文;王璇;;雞腸炎沙門氏菌診斷與防治技術(shù)的研究進(jìn)展[J];中國畜禽種業(yè);2012年04期

10 李干洲;龍曉峰;;鴨感染腸炎沙門氏菌的診斷[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2009年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 張鈺;鴨感染腸炎沙門氏菌應(yīng)答基因的作用及對產(chǎn)蛋性能的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2018年

2 陸廣富;腸炎沙門氏菌的分離鑒定與特異性檢測方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

3 董洪燕;腸炎沙門氏菌生物被膜形成相關(guān)基因鑒定、缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2011年

4 方軍;雞蛋孵化早期蛋清抗微生物特點(diǎn)及其作用機(jī)制[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李珉;腸炎沙門氏菌感染對濟(jì)寧百日雞盲腸全基因組甲基化的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 王莉莉;丁酸梭菌、轉(zhuǎn)移因子影響腸炎沙門氏菌L50分離株致病作用的分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 林麗麗;濟(jì)寧百日雞對腸炎沙門氏菌感染的免疫反應(yīng)及其腸道微生物多樣性變化[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

4 周羅雄;乳酸菌對肉雞腸道中腸炎沙門氏菌的抑菌作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

5 李念珍;戊糖片球菌對商品肉雞生產(chǎn)性能的影響及對腸炎沙門氏菌的抑制作用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 趙慧;麝鼠腸炎沙門氏菌PCR診斷方法的建立[D];延邊大學(xué);2008年

7 劉敏;MicroRNAs在雞感染腸炎沙門氏菌中的表達(dá)調(diào)控[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 陳雯雯;ChTLR15基因的多態(tài)性和脾臟中的表達(dá)水平與腸炎沙門氏菌感染的相關(guān)性研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2011年

9 宋詠梅;雞TLR4信號通路與腸炎沙門氏菌感染關(guān)系的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

10 呂靖;腸炎沙門氏菌SEF21和SEF14菌毛致病作用分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2012年

本文編號：2841319