禽致病性大腸桿菌是制約養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要病原之一,其O-抗原血清型具有高度復(fù)雜性,不同地區(qū)甚至同一地區(qū)的不同養(yǎng)禽場(chǎng)優(yōu)勢(shì)血清型不盡相同,根據(jù)不同血清型制作的疫苗之間不具備交叉保護(hù)力。但對(duì)同一養(yǎng)殖場(chǎng)而言,其致病性大腸桿菌的血清型在幾年內(nèi)是相對(duì)穩(wěn)定的,所以對(duì)不同地區(qū)養(yǎng)禽場(chǎng)致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型流行病學(xué)調(diào)查,根據(jù)其優(yōu)勢(shì)血清型制備相應(yīng)疫苗是防治禽大腸桿菌病的有效措施之一。本研究根據(jù)不同血清型大腸桿菌O-抗原合成基因簇具有特異性的特點(diǎn),以O(shè)-抗原基因簇中的寡糖單位翻轉(zhuǎn)酶基因(wzx)為靶基因,建立了檢測(cè)禽致病性大腸桿菌O1、O2、O78型的多重PCR方法。并優(yōu)化了引物濃度、Taq聚合酶濃度、10×Buffer用量、退火溫度、退火時(shí)間延伸溫度和延伸時(shí)間這幾個(gè)影響多重PCR擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素。優(yōu)化后的多重PCR擴(kuò)增體系為DNA模板,1μL;10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)Plus 20mM),2.5μL;dNTP Mixture(各2.5mM),2.5μL;Ex Taq酶(5U/μL),0.3μL;上下游引物(10pmol),各0.5μL;加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足至25μL。多重PCR擴(kuò)增參數(shù)為95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,59℃退火1.5min,72℃延伸1min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。DNA最低檢出濃度為100pg/μL,并具有特異性。應(yīng)用所建立的多重PCR方法檢測(cè)了54株APEC長春分離株的血清型,以驗(yàn)證所建立的多重PCR方法的穩(wěn)定性及實(shí)用性。結(jié)果顯示,54株APEC長春分離株中O1型檢出率為9.26%(5/54),O2型檢出率為7.41%(4/54),O78型檢出率為40.74%,O1、O2、O78型總體檢出率為57.41%(31/54)。為了評(píng)價(jià)多重PCR檢測(cè)方法的效果,使用傳統(tǒng)血清凝集法檢測(cè)54株APEC長春分離株的血清型,結(jié)果顯示兩種方法的符合率達(dá)85.19%(46/54),證明多重PCR檢測(cè)方法具有良好的檢測(cè)效果。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

圖 3.1 單重 PCR 擴(kuò)增結(jié)果adder K；1、2：E.coli O1（CVCC249）；3、4：5、6：E.coli O78（CVCC1555）Fig 3.1 PCR amplification results2：E.coli O1（CVCC249）；3、4：E.coli OE.coli O78（CVCC1555）與同源性比較 wzx 基因 PCR 產(chǎn)物測(cè)序與同源性比較CVCC249）的 DNA 為模板，按預(yù)實(shí)驗(yàn)zx 基因，將 PCR 產(chǎn)物回收純化后，送至結(jié)果呈遞 BLAST 系統(tǒng)作同源性分析，

圖 3.2 引物濃度對(duì)多重a：E.coli O1（CVCC249）；b：E.coli O2（M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) Ladder K；1-6 分別表示Fig 3.2 Effect of primer concentraa：E.coli O1（CVCC249）；b：E.coli O2（M：DNA Ladder K；1-6 indicate the concentratirespe3.3.2 Ex Taq 酶濃度的優(yōu)化在篩選出最佳引物濃度的基礎(chǔ)上，3.3 所示，當(dāng) Ex Taq 酶量為 5U、4U 和異性條帶。當(dāng) Ex Taq 酶量為 1.5U 時(shí)，以增反應(yīng)均較清晰的目的條帶，且有較少果較好。所以選取 1.5U 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（c）E.coli O78

圖 3.3 Ex Taq 酶濃度對(duì)多a：E.coli O1（CVCC249）；b：E.coli O2（M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) Ladder K；1-5 分別表Fig 3.3 Effect of Ex Taq enzymM：DNA Ladder K；1-5 indicate the quantity respe3.3.3 10×Ex Taq Buffer 量的優(yōu)化在上述最佳引物濃度、最佳酶濃度Taq Buffer 的用量，以探究最佳用量。從2.5μL 時(shí)，多重 PCR 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增拖帶情況出現(xiàn)。所以選取 2.5μL 進(jìn)行后（c）E.coli O78
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840787