為探究山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)N1L基因(gN1L)的生物學(xué)功能,本研究以痘苗病毒天壇株(vaccinia virus Tiantan,VTT)N1L基因(vN1L)片段為左右同源重組臂,構(gòu)建了含有VACV早/晚期強(qiáng)復(fù)合啟動(dòng)子(PE/L)、綠色熒光蛋白(EGFP)基因及大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLR-EGFP-gpt。分別向pLR-EGFP-gpt插入vN1L和gN1L基因表達(dá)盒,構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLR-EGFP-gpt-N1Lrev和pLR-EGFP-gpt-gN1L。將上述構(gòu)建的三個(gè)轉(zhuǎn)移載體分別與VTT共轉(zhuǎn)染于BHK-21細(xì)胞中,通過逐代對表達(dá)綠色熒光蛋白的重組病毒蝕斑進(jìn)行篩選和鑒定,最終獲得了缺失vN1L基因的重組毒株VTTΔN1L、缺失后再拯救vN1L基因的重組毒株VTTN1Lrev及用gN1L基因替換vN1L基因的毒株VTTgN1L。通過體外細(xì)胞試驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)評估重組病毒與親本毒株的穩(wěn)定性、宿主范圍、復(fù)制以及毒力的差異。結(jié)果顯示:構(gòu)建的三種重組病毒均可在BHK-21細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳15代以上,且宿主范圍無明顯差異;VTT N1Lrev在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制速度最快,其次分別為VTTgN1L、VTT和VTTΔN1L。初步證實(shí)vN1L和N1L基因具有促進(jìn)病毒復(fù)制速度的功能。體內(nèi)外毒力試驗(yàn)顯示:VTTN1Lrev毒力最強(qiáng),其次分別為VTTgN1L、VTT和VTTΔN1L,其中VTTgN1L和VTT的毒力并無明顯差異,VTTΔN1L毒力最低。結(jié)論,vN1L和gN1L基因均是病毒復(fù)制和毒力的相關(guān)基因,且gN1L基因可部分恢復(fù)gN1L基因的功能。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.654
【部分圖文】：

圖２－１．重組轉(zhuǎn)移載體ｐＬＲ－ＥＧＦＰ－ｇｐｔ的構(gòu)建流程圖??Ｆｉｇ．?２－１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｈｕｔｔｌｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＬＲ－ＥＧＦＰ－ｇｐｔ??１９??

Ｐｓｔｌ??ＴＫＲ?ＥｃｏＲＩ??圖２－２．重組轉(zhuǎn)移載體ｐＬＲ－ＥＧＦＰ－ｇｐｔ－ＮｌＬｒｃｖ的構(gòu)建流程圖??Ｆｉｇ．?２－２?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｈｕｔｔｌｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＬＲ－ＥＧＦＰ－ｇｐｔ－ＮｌＬｒｅｖ??２１??

－４．同源重組臂ＰＣＲ產(chǎn)物凝膠Ｍａｋｃｒ?；?１：左側(cè)臂ＰＣＲ產(chǎn)物；ｕｃｔｓ?ｏｆ?ｆｒａｎｋ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ?ｆｏｒ?ｈｏＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?；１?：ｌｅｆｔ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；定結(jié)果??ＭＩ和分別對ｐＬＲ－酶切，其中?ｐＬＲ－ＥＧＦＰ－ｇｒｅｖ?酶切片段為?４６１２ｂ為４６１２ｂｐ、７３４ｂｐ、５４８
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本文編號：2840685