豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的致人畜共患病病原,主要分布在亞洲及歐洲地區(qū),在其余大洲也有零星報(bào)道。該菌目前按血清型分型共計(jì)29個(gè)血清型,其中血清型2型(SS2)被廣泛報(bào)道為S.suis主要致病血清型。從有報(bào)道以來(lái),S.suis已在全球各洲造成上千人感染,幸存者也會(huì)留下多種后遺癥。它更是東南亞地區(qū)造成腦膜炎的主要細(xì)菌病原,給人類公共衛(wèi)生帶來(lái)了極大的威脅。尤其在中國(guó)SS2出現(xiàn)過(guò)兩次爆發(fā),極高的死亡率和伴隨的中毒樣休克綜合征(Streptococcus toxic shock like syndrome,STSLS)引起了世界廣泛關(guān)注。病原菌在侵入宿主致病的過(guò)程中,其毒力相關(guān)因子會(huì)隨著外界環(huán)境的變化而發(fā)生變化,這都要依靠轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)。本研究對(duì)SS2中89K上的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了篩選,并針對(duì)其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究,主要研究結(jié)果如下:1.篩選到一個(gè)影響豬鏈球菌致STSLS的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)宿主體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)候選的8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子大部分發(fā)生了上調(diào),對(duì)其逐一缺失并通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)確認(rèn),發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子tstS的缺失使SS2致病力大幅下降。由于其位于89K毒力島上,我們檢測(cè)了該缺失突變株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞炎性因子的刺激,發(fā)現(xiàn)其能力有顯著的下降。進(jìn)一步檢測(cè)小鼠血中含菌量及血清中炎性因子含量證實(shí),缺失tstS后其宿主體內(nèi)存活及激發(fā)高炎性因子的能力較顯著地減弱。但由于感染早期缺失突變株反而能夠引起宿主高炎性及之后的清除,我們以不含該基因的歐洲標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)1/7作為母本,將其導(dǎo)入過(guò)表達(dá)。結(jié)果顯示,獲得tstS后,P1/7菌株同樣獲得了激發(fā)高炎性因子的能力。結(jié)果顯示tstS的存在能夠提高菌株感染急性期促炎能力,對(duì)SS2致STSLS起著重要作用。2.發(fā)現(xiàn)tstS影響SS2的調(diào)控機(jī)制為了深入研究tstS影響SS2致STSLS的機(jī)制,我們通過(guò)基因芯片篩選缺失突變株△tstS與野生株05ZY的差異基因。經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn),大部分基因?qū)儆诩?xì)菌代謝相關(guān),此外還有Sspep、Fhb、Fhbp、SSU05_2103四個(gè)已被證實(shí)的豬鏈球菌表面毒力相關(guān)因子。而體外模擬環(huán)境刺激發(fā)現(xiàn),在葡萄糖匱乏的環(huán)境下,tstS的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)進(jìn)一步上升。經(jīng)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證,tstS受CcpA調(diào)控。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期研究,我們推測(cè)TstS與Fhbp以及CcpA間存在一定的聯(lián)系。將tstS啟動(dòng)子區(qū)CcpA結(jié)合序列插入tstS缺失突變株中Fhbp啟動(dòng)子區(qū)后,我們發(fā)現(xiàn)其葡萄糖攝取能力得到了恢復(fù),致病力也有一定的加強(qiáng)。因此我們確認(rèn)TstS通過(guò)Fhbp這個(gè)媒介與CcpA存在反饋調(diào)節(jié),促進(jìn)了SS2對(duì)低葡萄糖濃度環(huán)境的適應(yīng),增強(qiáng)了在該環(huán)境下莢膜等毒力相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)逃避宿主免疫系統(tǒng)清除,即使葡萄糖濃度極低的情況下,TstS同樣能夠通過(guò)其調(diào)控的Fhb以及Fhbp來(lái)完成免疫逃避。同時(shí)這是有關(guān)CcpA調(diào)控的新機(jī)制,為認(rèn)識(shí)和理解CcpA調(diào)控的精細(xì)化提供了新的視角。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

CPS 能夠阻礙 9 型豬鏈球菌對(duì) IPEC-J2 的粘附，對(duì) 2 型卻沒(méi)有影響，這其中的機(jī)制仍然是一片空白。Ferrando 等人于 2016 年提出了 SS2 粘附并侵入宿主腸上細(xì)胞的機(jī)制假說(shuō)：SS2 通過(guò)其表面多個(gè)蛋白特異性結(jié)合腸上皮細(xì)胞表面特定受體，例如通過(guò)鏈球結(jié)合蛋白（SadP）特異性結(jié)合 Gb3/CD77 受體(Ferrando et al 2017)、文提及的多個(gè) ECM 結(jié)合相關(guān)蛋白特異性結(jié)合胞外基質(zhì)；通過(guò)支鏈淀粉酶（ApuA結(jié)合宿主食物中淀粉等葡聚糖為細(xì)菌增殖提供能量(Ferrando et al 2010)；依靠 Sly 透明質(zhì)酸酶（Hyl）協(xié)作，降解 ECM 并形成孔洞，從而侵入血液循環(huán)并進(jìn)一步傳(Wu et al 2010)。在粘附侵入過(guò)程中，S. suis 還依靠 IgA1 水解酶、絲氨酸蛋白酶（SspA）、分泌性核酸酶（SsnA）來(lái)抵御宿主粘膜免疫系統(tǒng)，包括降解 IgA1、白胞介素-8（IL-8）以及中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)(de Buhr et al 2014; Zhao et al 2016; Li M et2017)。目前 Schultsz 課題組正在針對(duì)這一假說(shuō)展開(kāi)研究，并取得了一定的進(jìn)展(Ferrando et al 2017)。

圖 2-1：表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a 圖譜Figure2-1: The map for pET-28a vector表達(dá)與純化試驗(yàn)油菌保存：將測(cè)序正確的重構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21（平板，37℃培養(yǎng) 12-14 h，挑取單菌落接于 3 ml 相應(yīng)抗性℃，220r/min 振蕩培養(yǎng) 8-14 h。取 500 μ l 菌液和 500 μ 管，混勻后保存于-80℃冰箱；菌：剩余的菌液以 1:100 的比例接入 5ml 含相應(yīng)抗性的 L20 r/min 振蕩培養(yǎng)到 O D600 達(dá)到 0.6 時(shí)，加入終濃度為 20

豬鏈球菌致 STSLS 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選及其調(diào)控機(jī)制的研究力的對(duì)策之一。為了評(píng)價(jià)各轉(zhuǎn)錄因子在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)后的表達(dá)情況，本研SS2 感染其天然宿主豬及常用動(dòng)物模型小鼠，分離體內(nèi)細(xì)菌并提取 RNA，-PCR 檢測(cè)各轉(zhuǎn)錄因子在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，不論在小鼠還是豬體內(nèi)，除 SSU05_0937 略微下調(diào)以外，其余不同程度上調(diào)（如圖 2-2B 所示），其中 SSU05_0930 差異最顯著。這一結(jié)些基因可能在豬鏈球菌侵入宿主過(guò)程中扮演著重要的角色。
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