豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的致人畜共患病病原,主要分布在亞洲及歐洲地區(qū),在其余大洲也有零星報道。該菌目前按血清型分型共計29個血清型,其中血清型2型(SS2)被廣泛報道為S.suis主要致病血清型。從有報道以來,S.suis已在全球各洲造成上千人感染,幸存者也會留下多種后遺癥。它更是東南亞地區(qū)造成腦膜炎的主要細菌病原,給人類公共衛(wèi)生帶來了極大的威脅。尤其在中國SS2出現(xiàn)過兩次爆發(fā),極高的死亡率和伴隨的中毒樣休克綜合征(Streptococcus toxic shock like syndrome,STSLS)引起了世界廣泛關注。病原菌在侵入宿主致病的過程中,其毒力相關因子會隨著外界環(huán)境的變化而發(fā)生變化,這都要依靠轉錄因子來調節(jié)。本研究對SS2中89K上的轉錄因子進行了篩選,并針對其中一個轉錄因子調控機制進行了研究,主要研究結果如下:1.篩選到一個影響豬鏈球菌致STSLS的轉錄因子通過宿主體內誘導表達,我們發(fā)現(xiàn)候選的8個轉錄因子大部分發(fā)生了上調,對其逐一缺失并通過小鼠實驗確認,發(fā)現(xiàn)其中一個轉錄因子tstS的缺失使SS2致病力大幅下降。由于其位于89K毒力島上,我們檢測了該缺失突變株對小鼠巨噬細胞炎性因子的刺激,發(fā)現(xiàn)其能力有顯著的下降。進一步檢測小鼠血中含菌量及血清中炎性因子含量證實,缺失tstS后其宿主體內存活及激發(fā)高炎性因子的能力較顯著地減弱。但由于感染早期缺失突變株反而能夠引起宿主高炎性及之后的清除,我們以不含該基因的歐洲標準株P1/7作為母本,將其導入過表達。結果顯示,獲得tstS后,P1/7菌株同樣獲得了激發(fā)高炎性因子的能力。結果顯示tstS的存在能夠提高菌株感染急性期促炎能力,對SS2致STSLS起著重要作用。2.發(fā)現(xiàn)tstS影響SS2的調控機制為了深入研究tstS影響SS2致STSLS的機制,我們通過基因芯片篩選缺失突變株△tstS與野生株05ZY的差異基因。經GO分析發(fā)現(xiàn),大部分基因屬于細菌代謝相關,此外還有Sspep、Fhb、Fhbp、SSU05_2103四個已被證實的豬鏈球菌表面毒力相關因子。而體外模擬環(huán)境刺激發(fā)現(xiàn),在葡萄糖匱乏的環(huán)境下,tstS的轉錄水平會進一步上升。經凝膠遷移實驗(EMSA)驗證,tstS受CcpA調控。結合本實驗室前期研究,我們推測TstS與Fhbp以及CcpA間存在一定的聯(lián)系。將tstS啟動子區(qū)CcpA結合序列插入tstS缺失突變株中Fhbp啟動子區(qū)后,我們發(fā)現(xiàn)其葡萄糖攝取能力得到了恢復,致病力也有一定的加強。因此我們確認TstS通過Fhbp這個媒介與CcpA存在反饋調節(jié),促進了SS2對低葡萄糖濃度環(huán)境的適應,增強了在該環(huán)境下莢膜等毒力相關因子的表達來逃避宿主免疫系統(tǒng)清除,即使葡萄糖濃度極低的情況下,TstS同樣能夠通過其調控的Fhb以及Fhbp來完成免疫逃避。同時這是有關CcpA調控的新機制,為認識和理解CcpA調控的精細化提供了新的視角。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

CPS 能夠阻礙 9 型豬鏈球菌對 IPEC-J2 的粘附，對 2 型卻沒有影響，這其中的機制仍然是一片空白。Ferrando 等人于 2016 年提出了 SS2 粘附并侵入宿主腸上細胞的機制假說：SS2 通過其表面多個蛋白特異性結合腸上皮細胞表面特定受體，例如通過鏈球結合蛋白（SadP）特異性結合 Gb3/CD77 受體(Ferrando et al 2017)、文提及的多個 ECM 結合相關蛋白特異性結合胞外基質；通過支鏈淀粉酶（ApuA結合宿主食物中淀粉等葡聚糖為細菌增殖提供能量(Ferrando et al 2010)；依靠 Sly 透明質酸酶（Hyl）協(xié)作，降解 ECM 并形成孔洞，從而侵入血液循環(huán)并進一步傳(Wu et al 2010)。在粘附侵入過程中，S. suis 還依靠 IgA1 水解酶、絲氨酸蛋白酶（SspA）、分泌性核酸酶（SsnA）來抵御宿主粘膜免疫系統(tǒng)，包括降解 IgA1、白胞介素-8（IL-8）以及中性粒細胞誘捕網(de Buhr et al 2014; Zhao et al 2016; Li M et2017)。目前 Schultsz 課題組正在針對這一假說展開研究，并取得了一定的進展(Ferrando et al 2017)。

圖 2-1：表達質粒 pET-28a 圖譜Figure2-1: The map for pET-28a vector表達與純化試驗油菌保存：將測序正確的重構質粒轉化到 E.coli BL21（平板，37℃培養(yǎng) 12-14 h，挑取單菌落接于 3 ml 相應抗性℃，220r/min 振蕩培養(yǎng) 8-14 h。取 500 μ l 菌液和 500 μ 管，混勻后保存于-80℃冰箱；菌：剩余的菌液以 1:100 的比例接入 5ml 含相應抗性的 L20 r/min 振蕩培養(yǎng)到 O D600 達到 0.6 時，加入終濃度為 20

豬鏈球菌致 STSLS 相關轉錄因子的篩選及其調控機制的研究力的對策之一。為了評價各轉錄因子在宿主體內誘導后的表達情況，本研SS2 感染其天然宿主豬及常用動物模型小鼠，分離體內細菌并提取 RNA，-PCR 檢測各轉錄因子在宿主體內轉錄水平。結果顯示，不論在小鼠還是豬體內，除 SSU05_0937 略微下調以外，其余不同程度上調（如圖 2-2B 所示），其中 SSU05_0930 差異最顯著。這一結些基因可能在豬鏈球菌侵入宿主過程中扮演著重要的角色。
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本文編號：2835099