水貂是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,已發(fā)展形成重要的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。山東省是水貂養(yǎng)殖第一大省,但是隨著集約化、規(guī)�；B(yǎng)殖模式的形成,疫病嚴(yán)重妨礙了水貂養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。出血性肺炎是危害水貂的重要疫病之一。近年來,本實(shí)驗(yàn)室對水貂出血性肺炎進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果表明,除了綠膿桿菌、克雷伯菌、巴氏桿菌等致病菌外,應(yīng)該還有其他的病因。為此,本研究對肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)在水貂群中的流行情況進(jìn)行了調(diào)查,并對其致病性進(jìn)行研究,闡明兩者在水貂出血性肺炎中的作用。自2017-2018年期間,從山東諸城水貂養(yǎng)殖場采取水貂肺炎病料120份,共分離到2株肺炎雙球菌(Sp-1,Sp-2)和3株金黃色葡萄球菌(Sa-6,Sa-16,Sa-24)。采用分子克隆測序技術(shù),分別對所分離的肺炎雙球菌的9種毒力基因、金黃色葡萄球菌的17種毒力基因進(jìn)行檢測、分析。結(jié)果表明,2株肺炎雙球菌均攜帶ply、nan A、lyt A、psp A、psa A及rrg A基因,Sp-1分離株還攜帶有pav A,hys A毒力基因,而iga基因均為陰性;3株金黃色葡萄球菌分離株中,Sa-16,Sa-24分離株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),Sa-6分離株為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA),其中MSSA攜帶pvl基因,3株金黃色葡萄球菌均攜帶coa、nuc和clf A基因,其中,Sa-6,Sa-24兩株同時(shí)攜帶hla、hlb、hld和hlg 4種溶血素基因及Fnbp B毒力基因,腸毒素作為食物中毒病例中重要的致病因素之一,在本研究中只有Sa-6分離株腸毒素seb、seg基因檢測為陽性,表皮剝落毒素基因eta、etb及tsst-1均未檢出。采用紙片擴(kuò)散法對5株細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行了檢測,共使用9大類共21種抗生素。本研究中Sp-1,Sp-2分離株對羅紅霉素完全耐藥,對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素和阿米卡星均敏感。2株MRSA菌株相較于不攜帶mec A基因的菌株,MRSA菌株對臨床上常用的抗生素具有更高程度的耐藥性,對青霉素類(氨芐西林、青霉素)和磺胺類(復(fù)方新諾明)藥物完全耐藥,只有部分喹諾酮類(環(huán)丙沙星、諾氟沙星)、頭孢菌素類(頭孢他啶、頭孢西丁)藥物對Sa-16,Sa-24分離株顯示較好的抑菌作用。Sa-6分離株對復(fù)方新諾明完全耐藥,喹諾酮類、硝基呋喃類、糖肽類及多數(shù)頭孢菌素類藥物均對MSSA分離株顯示較好的抑菌作用。根據(jù)分離菌株毒力基因檢測結(jié)果,分別選取肺炎雙球菌分離株Sp-1和金黃色葡萄球菌分離株Sa-6進(jìn)行致病性研究。在小鼠致病性試驗(yàn)中,通過腹腔接種途徑對小白鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn),結(jié)合臨床癥狀觀察及小鼠發(fā)病時(shí)間和死亡率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明,Sa-6分離株對小鼠的致病性比Sp-1分離株強(qiáng)。之后,回歸實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,將Sp-1分離株和Sa-6分離株分別通過腹腔接種、肌肉注射和鼻腔接種共3種不同攻毒途徑感染水貂。根據(jù)感染水貂不同器官中目的菌回收率,并結(jié)合組織病理學(xué)變化,確定了分離株對水貂具有致病性,同時(shí)比較肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌經(jīng)不同途徑感染,其對水貂致病性強(qiáng)弱的差異。結(jié)果表明:肺炎雙球菌分離株經(jīng)鼻腔感染水貂,病原菌更易通過在鼻咽部的定植,進(jìn)而從鼻咽部經(jīng)呼吸道下行,引起肺部感染,而金黃色葡萄球菌分離株則易經(jīng)破損的皮膚感染水貂,引起水貂化膿性感染、蜂窩織炎等。本研究表明,肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌在貂群中存在,并可引起水貂肺炎病征。這一結(jié)果豐富了水貂出血性肺炎的研究數(shù)據(jù),具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義和生產(chǎn)實(shí)踐意義。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文驗(yàn)結(jié)果菌的分離鑒定 120 份水貂肺炎病料中分別采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，無菌操線接種于 LB 固體培養(yǎng)基平板，進(jìn)行細(xì)菌的分離及鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)，純培氏染色鏡檢（圖 3），將疑似為肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)菌保存菌種。A B

圖 3 分離菌株革蘭氏染色鏡檢圖（A：肺炎雙球菌，B：金黃色葡萄球Gram's staining microscope（A. Streptococcus pneumoniae, B. Staphyloco離菌株的基因組 DNA，以 16S rRNA 為引物擴(kuò)增細(xì)菌進(jìn)行 1％瓊脂糖凝膠電泳，片段大小（1500 bp）與預(yù)段的凝膠按照Gel Extraction Kit 試劑盒說明書進(jìn)行膠果提交 NCBI 進(jìn)行 BLAST 相似性比對分析，最終確定株肺炎雙球菌和 3 株金黃色葡萄球菌。2000M 1 2 3 4 5 6bp

貂源肺炎雙球菌和金黃色葡萄球菌的毒力基因檢測及其致病性研究檢測雙球菌和金黃色葡萄球菌的目的菌株，分別采用 PCR。肺炎雙球菌主要毒力因子有溶血素、神經(jīng)氨酸酶（包自溶酶、肺炎球菌表面蛋白（分為 A、C 兩種），肺炎毒力因子 A、菌毛和透明質(zhì)酸酶等（圖 5）。金黃色葡溶血素（分為α、β、γ、δ-溶血素四種），殺白細(xì)胞腸毒素）、毒性休克綜合征毒素-1、表皮剝脫毒素（分固酶、凝聚因子、耐熱核酸酶及耐甲氧西林抗藥性基因增產(chǎn)物進(jìn)行 1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證該菌株是否含有目的黃色葡萄球菌的部分毒力基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2834901