本研究通過六個試驗研究了日糧添加精氨酸對腸道致病菌感染的肉仔雞腸道黏膜損傷的影響及機(jī)理。試驗一旨在研究肉仔雞空腸物理屏障相關(guān)基因表達(dá)的發(fā)育性變化。試驗于肉仔雞第1、7、14、21、28和35日齡采集空腸組織檢測緊密連接和粘附連接蛋白的mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示:1日齡時claudin-1表達(dá)顯著高于其余日齡,而其他日齡之間無顯著差異。Claudin-2表達(dá)在前14天逐漸增加,14-21日齡急劇下降,21-35日齡為平臺期。Claudin-3表達(dá)在1-7日齡為平臺期,7-21日齡逐漸升高,21-35日齡逐漸下降。Claudin-5在前21天逐漸增加,21-28日齡逐漸下降,28-35日齡為平臺期。Occludin和ZO-1的發(fā)育模式相似,在1-14日齡逐漸增加,14-35日齡為平臺期。ZO-2在前28天逐漸增加,28-35日齡逐漸下降。ZO-3和E-cadherin的發(fā)育模式相似,前21天逐漸增加,后 14 天逐漸降低。此外,Claudin-3、claudin-5、occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3 和 E-cadherin表達(dá)隨日齡呈現(xiàn)極顯著的二次曲線效應(yīng),且兩兩之間皆具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果表明,1-14日齡是物理屏障相關(guān)基因(除claudin-1和claudin-3)表達(dá)的上升期,而28-35日齡是平臺期(除claudin-3和ZO-2)。物理屏障相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性可能由于它們結(jié)構(gòu)上的相互作用。試驗二旨在探究精氨酸水平與飼喂時間對患壞死性腸炎肉仔雞的腸道免疫和屏障功能的影響。采用3×2因子隨機(jī)試驗設(shè)計,包括3種日糧處理:全期飼喂基礎(chǔ)日糧(含精氨酸1.25%);全期飼喂含精氨酸1.87%日糧;前期(1-8日齡)飼喂基礎(chǔ)日糧,后期(9-28日齡)飼喂含精氨酸1.87%日糧。2種攻毒處理為:不感染;或在第10日齡感染球蟲,并在14-20日齡感染產(chǎn)氣莢膜梭菌。于21和28日齡采樣。結(jié)果顯示攻毒導(dǎo)致腸道損傷,表現(xiàn)為降低血漿D-木糖濃度、提高回腸通透性、促進(jìn)盲腸食糜中大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量;精氨酸添加可緩解上述現(xiàn)象。攻毒降低28日齡空腸sIgA含量,而精氨酸促進(jìn)其分泌。攻毒顯著降低腸道claudin-1和occludinmRNA表達(dá),而精氨酸可抑制這種現(xiàn)象。攻毒上調(diào)腸道中claudin-2、IFN-γ、TLR-2和NOD1 mRNA表達(dá)量,而精氨酸促進(jìn)IFN-γ、IL-10和NOD1 mRNA表達(dá)量。上述結(jié)果表明,精氨酸可以通過促進(jìn)固有免疫反應(yīng)和維護(hù)腸道屏障功能緩解壞死性腸炎造成的肉仔雞腸道黏膜損傷,降低產(chǎn)氣莢膜梭菌定植。試驗全期飼喂含精氨酸1.87%的日糧效果較佳。試驗三旨在研究精氨酸對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的肉仔雞腸道炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制。采用2×2因子隨機(jī)試驗設(shè)計,包含2種日糧精氨酸濃度(1.42%和1.72%)和2個攻毒狀態(tài)(不感染或14-20日齡感染產(chǎn)氣莢膜梭菌),于21日齡和28日齡采集樣品。結(jié)果顯示產(chǎn)氣莢膜梭菌感染顯著升高血清降鈣素原和尿素氮濃度。精氨酸添加顯著降低血清二胺氧化酶、髓過氧化物酶活力和一氧化氮濃度。精氨酸添加緩解了感染引起的血清精氨酸和鳥氨酸濃度的下降,并緩解了感染引起的腸道損傷評分、空腸組織形態(tài)損傷、空腸粘膜溶菌酶酶活和iNOS酶活的提高。感染使空腸促炎細(xì)胞因子(IL-6、IFN-γ、IL-1β)和抗炎細(xì)胞因子(TGF-β)mRNA表達(dá)量升高,而精氨酸添加則降低這些細(xì)胞因子的表達(dá)。感染促進(jìn)21日齡空腸抗菌肽Cathelicidins(CATH)1和CATH3mRNA表達(dá),而降低28日齡空腸禽β防御素(AvBD)1、AvBD2、CATH3和肝臟表達(dá)抗菌肽(LEAP)2mRNA表達(dá)量。精氨酸添加降低21日齡AvBD1、AvBD2、CATH1和CATH3mRNA表達(dá)量。感染升高空腸堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(CAT)-1、CAT-2和CAT-3 mRNA表達(dá)量,并升高精氨酸分解酶——誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶2(ARG2)、精氨酸脫羧酶(ADC)和精氨酸:甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(AGAT)的mRNA表達(dá)量;而添加精氨酸顯著降低上述3種堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和4種精氨酸酶的過量表達(dá)。精氨酸添加顯著減低感染誘導(dǎo)的空腸Janus激酶(JAK)1、JAK2、JAK3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)1和STAT6mRNA的高表達(dá)。上述結(jié)果表明,日糧精氨酸能預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌感染誘導(dǎo)的肉仔雞循環(huán)精氨酸缺乏,使精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝恢復(fù)正常,下調(diào)激活的JAK-STAT信號通路,從而緩解炎癥反應(yīng)和腸道黏膜損傷。試驗四旨在研究精氨酸添加對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞腸道微生物區(qū)系組成和功能的影響。試驗采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計,分為3個處理:對照組、產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組、飼喂精氨酸添加日糧的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染組。在14-20日齡進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒,21日齡采集回腸食糜。結(jié)果顯示3個處理的微生物區(qū)系明顯不同,但對照組與精氨酸添加組的微生物結(jié)構(gòu)較為相似。精氨酸能顯著緩解產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的厚壁菌門豐度的下降,并顯著緩解變形菌門等7種菌門豐度的升高。屬水平T-test分析顯示,感染引起24個屬的相對豐度顯著升高,且其中15個屬屬于變形菌門,精氨酸添加能顯著抑制其中23個屬。飼喂精氨酸的感染肉雞與健康肉雞僅有3個屬的豐度顯著不同。LEfSe分析顯示產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒組富含多種變形菌綱,而對照組富含瘤胃球菌科和格氏乳桿菌,感染情況下精氨酸添加組富含梭菌目和乳桿菌目。PICRUST(基于16S rRNA擴(kuò)增子測序結(jié)果預(yù)測微生物群落功能)分析顯示精氨酸可顯著緩解感染引起的大多數(shù)微生物基因通路的變化,其中感染引起的代謝、人類疾病和細(xì)胞進(jìn)程基因豐度的上調(diào)可被精氨酸顯著抑制,感染引起的遺傳信息處理和環(huán)境信息處理基因豐度的下調(diào)可被精氨酸顯著促進(jìn)。以上結(jié)果表明,日糧添加精氨酸可提高梭菌目和乳桿菌目等潛在有益菌的數(shù)量,減少變形菌門下的有害菌生長,抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的腸道微生物代謝和人類疾病等基因豐度的增加,將感染肉仔雞的腸道微生物菌群組成和功能調(diào)整到與健康肉仔雞相似。試驗五旨在研究精氨酸對鼠傷寒沙門氏菌感染肉仔雞引起的腸道損傷的緩解作用。采用2×2因子隨機(jī)試驗設(shè)計,包含2種日糧精氨酸濃度(1.42%和1.72%)和2個攻毒狀態(tài)(不感染和8-10、13-16日齡感染鼠傷寒沙門氏菌)。在17和23日齡采集樣品。結(jié)果顯示精氨酸添加降低感染引起的血清二胺氧化酶活力和降鈣素原含量的升高。感染降低血清精氨酸濃度,補(bǔ)充精氨酸緩解這一現(xiàn)象。在感染條件下,添加精氨酸提高17日齡血清鳥氨酸和尿素氮含量。精氨酸添加緩解感染造成的腸道形態(tài)學(xué)損傷。在17日齡,感染提高空腸IL-17mRNA表達(dá)量,降低NF-κB、IFN-γ和IL-10 mRNA表達(dá)量。精氨酸添加提高空腸IFN-y并降低IL-22 mRNA表達(dá)量。在23日齡,感染提高空腸IL-1β、IL-10、IL-17、IL-8和IL-22mRNA表達(dá),精氨酸添加提高空腸IFN-γ和IL-10 mRNA表達(dá)量并降低IL-22 mRNA表達(dá)量。感染降低17日齡空腸多種抗菌肽mRNA表達(dá)量和23日齡空腸LEAP2mRNA表達(dá)量,升高23日齡空腸三葉因子(TFF)2mRNA表達(dá)量。精氨酸添加升高17日齡空腸TFF2 mRNA表達(dá)量,降低23日齡空腸多種抗菌肽表達(dá)量但升高LEAP2 mRNA表達(dá)量。感染提高空腸CAT-1、CAT-2、CAT-3mRNA表達(dá)量,精氨酸添加繼續(xù)促進(jìn)三者表達(dá)增加。感染顯著降低17日齡空腸ARG2 mRNA表達(dá)量,提高23日齡空腸ADC和AGAT mRNA表達(dá)量,精氨酸添加繼續(xù)促進(jìn)23日齡ADCmRNA表達(dá)量。以上結(jié)果表明,沙門氏菌感染造成循環(huán)精氨酸缺乏,促進(jìn)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn),誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。精氨酸添加維護(hù)腸道形態(tài),緩解沙門氏菌感染的不利影響,促進(jìn)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和抗菌肽表達(dá),尤其是促進(jìn)IFN-y產(chǎn)生,有利于細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌的清除。本試驗與試驗三的結(jié)果比較可知,產(chǎn)氣莢膜梭菌感染和沙門氏菌感染都可引起機(jī)體循環(huán)精氨酸缺乏,誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)和腸道損傷,促進(jìn)腸道堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)。日糧補(bǔ)充精氨酸都可增加機(jī)體循環(huán)精氨酸濃度,緩解腸道損傷。但兩種疾病模型的病理過程不同:產(chǎn)氣莢膜梭菌在感染前期即可誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng),感染后期腸道炎癥反應(yīng)減弱;而沙門氏菌在感染前期使IFN-γ、NF-κB和大量抗菌肽表達(dá)下降,可能有助于沙門氏菌逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)清除,感染后期誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。精氨酸的調(diào)節(jié)機(jī)制也有所不同:在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染中,精氨酸緩解了精氨酸分解酶、促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子和抗菌肽等的過度表達(dá),這種調(diào)節(jié)作用是一致的,可能與提高循環(huán)精氨酸濃度進(jìn)而反饋抑制腸道精氨酸過度轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);而在沙門氏菌感染中,精氨酸對不同分子的調(diào)節(jié)作用不同,精氨酸發(fā)揮保護(hù)作用可能與促進(jìn)IFN-γ、增強(qiáng)T細(xì)胞數(shù)量和功能有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。試驗六旨在研究精氨酸對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的雞胚腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示產(chǎn)氣莢膜梭菌感染對細(xì)胞毒性、IL-1β、IL-6、IL-8和iNOS mRNA表達(dá)量的提高具有具有劑量和時間依賴性。適于構(gòu)建感染模型的劑量和時間分別是感染復(fù)數(shù)為1,處理4h。50和/或400μM精氨酸可顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的細(xì)胞毒性、堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(CAT-1和CAT-3)、iNOS和炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL8和IL10)的基因表達(dá)量的升高,繼續(xù)升高感染刺激的IFN-γ和ARG2 mRNA表達(dá)。400μM比50μM精氨酸更利于緩解炎癥。以上結(jié)果表明,精氨酸可通過緩解產(chǎn)氣莢膜梭菌感染誘導(dǎo)的CATs、iNOS及炎性細(xì)胞因子的增加來減少雞胚腸上皮細(xì)胞的死亡,與試驗三動物試驗結(jié)果基本一致。以上研究表明,日糧精氨酸可通過增加機(jī)體循環(huán)精氨酸濃度,影響腸道精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)和抗菌肽表達(dá),改善腸道機(jī)械屏障功能,調(diào)節(jié)腸道微生物菌群組成和功能,緩解腸道致病菌造成的肉仔雞腸道黏膜損傷。精氨酸添加日糧在全期飼喂的效果優(yōu)于僅在感染期飼喂的效果。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S831.5
【部分圖文】：

２．１精氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)逡逑精氨酸（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ），化學(xué)名稱為２－氨基－５－胍基戊酸，是一種堿性氨基酸。其分子式為逡逑Ｃ６Ｈ１４Ｎ４０２，分子量為１７４．２０，結(jié)構(gòu)如圖１所示。最早于１８８６年由Ｓｃｈｕｌｚｅ從羽扇豆芽苗中分離逡逑并命名，１８９５年Ｈｅｄｉｎ從動物蛋白中分離出精氨酸。精氨酸有Ｄ型和Ｌ型兩種同分異構(gòu)體，僅逡逑Ｌ型在生物體內(nèi)具有生理作用。逡逑Ｈ邐Ｈ邋ＮＨ２逡逑ＮＨ邐Ｏ逡逑圖１精氨酸的結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｉ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｒｇｉｎｉｎｅ逡逑人和晡乳動物在正常情況下體內(nèi)合成的精氨酸可滿足自身生長發(fā)育需要，但在某些情況下，逡逑如幼齡、孕期、創(chuàng)傷和嚴(yán)重敗血癥，內(nèi)源合成的精氨酸不能滿足需要，需要外源補(bǔ)充精氨酸（Ｇｏｂｅｒｔ逡逑等，２００４；邋Ｃｈａｕ等，２０１３），因此精氨酸是人和哺乳動物的條件性必需氨基酸。由于家禽缺乏氨逡逑１逡逑

邐第一章文獻(xiàn)綜述逡逑腸道是維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡和阻礙致病菌及毒素的先天性屏障。腸道屏障包括機(jī)械屏障、化逡逑學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障（如圖３）。逡逑機(jī)械屏障又叫物理屏障，其生理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是黏膜上皮、固有層和黏膜肌層。腸上皮細(xì)胞通過逡逑細(xì)胞連接緊密排列，細(xì)胞之間的連接由緊密連接、黏附連接和橋粒等組成，能有效的阻擋細(xì)菌、逡逑病毒及內(nèi)毒素進(jìn)入。逡逑化學(xué)屏障由腸上皮細(xì)胞所分泌的粘液、消化液及正常菌分泌的抑菌物質(zhì)組成。腸粘膜上皮細(xì)逡逑胞夾雜著大量的杯狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞分泌粘液，枯液層呈半透明狀，連續(xù)分布于腸黏膜表面，與逡逑腸道上皮細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)競爭，阻礙細(xì)菌與腸上皮結(jié)合。腸道抑菌物質(zhì)主要有膽汁、粘多糖、溶菌逡逑酶和糖蛋白等。胃酸呈酸性，可殺滅從口腔進(jìn)入的大部分細(xì)菌，酸性環(huán)境可起到保護(hù)腸道免受病逡逑原菌感染的作用。肝臟分泌的膽汁和小腸液對病原菌增殖也具有一定的抑制作用。逡逑腸道菌群主要包括黏膜菌群和腸腔菌群，黏膜菌群主要以雙歧桿菌和乳酸菌為主，腸腔菌群逡逑多為大腸桿菌和腸球菌，它們黏附在腸道黏膜層上，形成了一個多層次的腸道微生物屏障。正常逡逑情況下腸道微生物數(shù)量、分布相對恒定

（＆＞ｎｄａＳｐｐ．）在誘導(dǎo)壞死性腸炎病變中具有協(xié)同作用。與僅感染艾美爾球蟲或僅感染產(chǎn)氣莢膜逡逑梭菌的肉雞相比，產(chǎn)氣莢膜梭菌與艾美爾球蟲卵或與過量含有弱毒艾美爾球蟲疫苗共同感染導(dǎo)致逡逑更多肉雞出現(xiàn)病變或死亡率更高（Ｐａｒｋ等，２００８；邋Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等，２００８）。如圖４所示，當(dāng)存在球蟲逡逑病時，壞死性腸炎發(fā)病過程如下（Ｔｉｍｂｅｒｍｏｎｔ等，２０１１）：艾美爾球蟲在小腸中定植并殺死腸上逡逑皮細(xì)胞，由此產(chǎn)生的腸上皮細(xì)胞之間的縫隙使血漿蛋白滲漏到腸腔中，產(chǎn)氣莢膜梭菌可利用血漿逡逑蛋白作為其生長基質(zhì)。此外，球蟲感染誘導(dǎo)Ｔ細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，能促進(jìn)腸道粘液生成（步驟逡逑Ｂ），由于產(chǎn)氣莢膜梭菌能以粘液為底物，因此粘蛋白合成增加也為產(chǎn)氣莢膜梭菌提供了有利的生逡逑長條件。致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株通過產(chǎn)生細(xì)菌素而抑制其他產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，盡可能地獲得逡逑由球蟲感染而增加的營養(yǎng)物質(zhì)（步驟Ｃ）。壞死性腸炎的病理變化始于腸上皮細(xì)胞的基底測和外逡逑側(cè)區(qū)域，然后逐漸擴(kuò)展到整個固有層。宿主膠原酶和由致病性產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的膠原蛋白水解逡逑酶可能在此過程中起作用（步驟Ｄ）。ＮｅｔＢ可使腸細(xì)胞產(chǎn)生小孔，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而誘發(fā)壞死逡逑性病變（步驟Ｅ）。細(xì)胞外基質(zhì)分子（ＥＣＭＭ

本文編號：2834889