生殖干細(xì)胞在有性繁殖的生物中肩負(fù)著將遺傳信息在世代中傳遞的重要任務(wù),通過精卵結(jié)合產(chǎn)生新的個(gè)體。對(duì)于具有這些特殊性質(zhì)的生殖干細(xì)胞,科學(xué)家們?cè)缭谑昵熬椭铝τ隗w外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化成精子和卵子的研究,試圖使得精子和卵子能源源不斷地通過體外分化產(chǎn)生,這一研究一旦取得成功,將對(duì)了解生殖細(xì)胞的發(fā)生、調(diào)控機(jī)理、遺傳修飾以及臨床治療不育疾病產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義的影響。多年以來,對(duì)于其發(fā)生機(jī)制的研究從未停止過,其主要涉及到關(guān)鍵基因、生長(zhǎng)因子等因素的調(diào)控,而隨著研究的深入,lncRNA在細(xì)胞分化中發(fā)揮的重要作用逐漸被人發(fā)現(xiàn)。lncRNA作為一度被忽視的角色,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),其在生物學(xué)過程中發(fā)揮著不可替代的作用。由于lncRNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控許多生理過程中的作用,已得到較為深刻的認(rèn)知,但對(duì)生殖細(xì)胞分化的調(diào)控研究相對(duì)較少。本研究通過單細(xì)胞的高通量測(cè)序方法檢測(cè)了雞胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)、原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells,PGCs)、精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)、成纖維細(xì)胞(CEFs)四種細(xì)胞的lncRNA表達(dá)模式,通過對(duì)結(jié)果的比較分析,發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化這一個(gè)復(fù)雜的過程中有眾多的lncRNA參與其中。而PGCs作為生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞,對(duì)其調(diào)控的研究具有重要的意義。多年以來,對(duì)于PGCs發(fā)生機(jī)制的研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn),其中主要集中在一些內(nèi)源性調(diào)控因素以及外源性活性物質(zhì),而lncRNA在PGCs的發(fā)生過程中所扮演怎樣的角色,還少有報(bào)道,本研究篩選出其中在PGCs中特異高表達(dá)的lncRNA,TCONS_00948124,在 ESCs 和 SSCs 中低表達(dá),推測(cè)該 lncRNA 可能參與了 PGCs的發(fā)育調(diào)控,將其命名為PGClnc1。為了系統(tǒng)地研究PGClnc1的功能與機(jī)制,本研究通過對(duì)PGClnc1進(jìn)行功能性獲得和缺失,旨在探索其在PGCs形成過程中的功能及其參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控因素;利用RNA-Pull Down,質(zhì)譜分析等技術(shù)探究與其互作的蛋白及其調(diào)節(jié)方式,以及探究PGClnc1與cis預(yù)測(cè)的靶基因BTRC,兩者與miRNA之間的ceRNA競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制:為闡明PGClnc1在PGCs形成過程中的分子調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。研究結(jié)果如下:(1)ESCs向PGCs和SSCs分化過程的lncRNA單細(xì)胞測(cè)序分析收集雞的ESCs、PGCs、SSCs、CEFs細(xì)胞,提取RNA,進(jìn)行RNA-seq,篩選出參與胚胎干細(xì)胞(ESCs)向雄性生殖細(xì)胞(PGCs、SSCs)分化過程的差異lncRNA,其中8個(gè)lncRNA與ESCs對(duì)PGC組的表達(dá)變化超過10倍,而在ESCs與SSCs組中的4個(gè)lncRNA和PGCs與SSCs組的1個(gè)相關(guān) lncRNA 表達(dá)變化超過 10 倍,包括 STRA8,WDR91,WNT7A,PTPDC1,BARX1等。對(duì)DELs進(jìn)行GO功能注釋表明,超過75%的DELs富集于生物過程,包括細(xì)胞因子刺激反應(yīng)、分化;超過15%DELs富集在分子功能,與miRNA、雙鏈DNA結(jié)合有關(guān);而超過8%的DELs富集于細(xì)胞成分,與細(xì)胞膜表面、細(xì)胞器子室相關(guān)。DELs的KEGG通路富集分析,20個(gè)信號(hào)通路顯著富集于三組中,包括Jak-STAT signaling pathway和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、葉酸生物合成(Folate biosynthesis)、TGF-beta signaling pathway、Wnt signaling pathway 和 mTOR signaling pathway、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(Proteinprocessing in endoplasmic reticulum)、嘌呤代謝(Purine metabolism)、胰島素信號(hào)通路(Insulin signaling pathway)和 Hedgehog signaling pathway等。在這些信號(hào)通路中,DELs 主要包括 ENSGALG00000002005、ENSGALG00000005733、ENSGALG00000002403、ENSGALG00000001967、ENSGALG00000003339、ENSGALG00000006431、ENSGALG00000006794 等。熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示這些lncRNA的表達(dá)量與RNA-seq結(jié)果相一致。(2)PGClnc1的篩選與鑒定對(duì)篩選獲得的差異lncRNA進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),在ESCsvs PGCs、ESCs vs SSCs 和 PGCs vs SSCs 組分別有 354,654 和 239 個(gè)特異 novel lncRNA;且共有367個(gè)特異表達(dá)lncRANA參與生殖細(xì)胞分化,其中包括ENSGALG0000000038,ENSGALG0000015297,ENSGALG0000011415 等;KEGG 通路富集結(jié)果表明 XLOC_612989(ACVR2A)、XLOC_478357(Lef-1)、XLOC_225283(MAPK1)等 lncRNA 能夠顯著的富集于18條參與雄性生殖細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號(hào)通路,如TGF-β,Notch和Jak-STAT等信號(hào)通路;其中PGCs特異表達(dá)的lncRNA(TCONS_00948124)顯著富集于TGF-β signaling pathway,命名為PGClnc1;表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果表明:PGClnc1在性腺中高表達(dá),且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,擴(kuò)增PGClnc1的4個(gè)開放閱讀框(ORF2、ORF3、ORF6、ORF8),連接帶有his標(biāo)簽的原核融合表達(dá)載體pET28a(+)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PGClnc1的ORF2可誘導(dǎo)表達(dá)his標(biāo)簽蛋白,進(jìn)而確定PGClnc1具有編碼小肽的能力。(3)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)PGClnc1差異表達(dá)結(jié)合NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫,確定PGClnc1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp左右的序列為PGClncq1啟動(dòng)子并克隆,置換擴(kuò)增pEGFP--N1載體中的CMV啟動(dòng)子,將重組載體pPGClnc1-EGFP進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,綠色熒光能夠正常表達(dá),說明克隆的PGClnc1啟動(dòng)子區(qū)域具有活性.,通過缺失片段克隆技術(shù),構(gòu)建PGClnc1啟動(dòng)子不同缺失片段載體PGL3-P1～PGL3-P6,并通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PGClnc1啟動(dòng)子核心區(qū)域?yàn)?1033～-661bp;PGClnc1啟動(dòng)子核心區(qū)域存在STAT1、TCF7L2、Sox2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)同時(shí)構(gòu)建相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子點(diǎn)突變載體,通過雙熒光素報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的活性都有一定的正向調(diào)控作用,其中TCF7L2作用極顯著;利用5-Azadc(1Oμmol/L)、TSA(1μmol/L)處理轉(zhuǎn)染PGL3-P1的DF-1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)DNA甲基化抑制劑5-Azadc以及組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA處理后,PGClnc1啟動(dòng)子活性由8.36±3.33上升至68.99±2.29、141.7±3.12,表明降低DNA甲基化水平和提高組蛋白乙�；侥軌蛱岣逷GClnc1啟動(dòng)子活性。(4)PGClnc1在PGCs形成過程中的功能針對(duì)PGClnc1序列設(shè)計(jì)3個(gè)shRNA靶位點(diǎn),構(gòu)建慢病毒干擾載體,并進(jìn)行慢病毒包裹,以qRT-PCR檢測(cè)慢病毒干擾載體的干擾效率。成功構(gòu)建干擾載體PGClnc1-sh1、PGClnc1-sh2和PGClnc1-sh3,干擾效率分別為29%±0.04、77%±0.02和47%±0.05(P0.01),通過體內(nèi)和體外兩個(gè)水平研究PGClnc1在PGCs形成過程中的功能,結(jié)果顯示:體外實(shí)驗(yàn)過程中,在過表達(dá)組誘導(dǎo)4天后能出現(xiàn)生殖樣細(xì)胞,且生殖標(biāo)記基因有顯著性的上調(diào)表達(dá),敲除組在相同的情況下則不能。流式細(xì)胞分選結(jié)果表明,在第4d,正常誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中類PGCs樣細(xì)胞所占比例為4.5%±0.19,而在過表達(dá)PGClnc1后,比例上升至5.9%±0.21(P0.01),相對(duì)地,敲低PGClnc1后,比例顯著下降至1.1%±0.2(P0.01)。熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示PGClnc1敲低后PGCs的標(biāo)記基因cvh的表達(dá)(0.3412±0.03)與正常組(1.02454±0.03)相比出現(xiàn)了顯著的下調(diào)(P0.01);間接免疫熒光結(jié)果顯示,相對(duì)于RA誘導(dǎo)組,過表達(dá)PGClnc1后CVH蛋白表達(dá)增加,而在敲低PGClnc1后,CVH蛋白表達(dá)卻顯著下降;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程中,雞胚注射慢病毒載體10μL 106TU/mL+90μLDMEM,注射后能夠穩(wěn)定表達(dá)EGFP且雞胚能夠激發(fā)綠色熒光。qRT-PCR結(jié)果顯示在敲低PGClnc1后,cvh、c-kit生殖相關(guān)基因大幅度下降到0.245±0.199、0.17±0.0458,過表達(dá)PGClnc1,體內(nèi)各個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生了相反的變化,其中 cvh、c-kit大幅上升至 0.67±0.02、0.85±0.01(P0.05);PAS 結(jié)果顯示敲低 PGClnc1能夠顯著降低PGCs的產(chǎn)生。流式細(xì)胞分選結(jié)果顯示,在control組中cvh陽性細(xì)胞率所占比例為4.2%±0.21,而在過表達(dá)PGClnc1后,cvh陽性細(xì)胞率所占比例上升至5.8%±0.15(P0.01),相對(duì)地,敲低PGClnc1后,cvh陽性細(xì)胞率所占比例下降至1%±0.19(P0.01)。(5)PGClnc1調(diào)節(jié)PGCs形成過程的分子調(diào)控機(jī)制探究對(duì)PGClnc1的序列進(jìn)行RNA-pull down和質(zhì)譜分析,成功獲取23個(gè)與PGClnc1互作的蛋白,其中包括GAPDH,KRT5,KRT19,LOC776816等已知蛋白以及其他未知蛋白;GAPDH參與調(diào)控TGF-β信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),與本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)TGF-β信號(hào)通路對(duì)生殖細(xì)胞分化影響的結(jié)果相結(jié)合,并且對(duì)PGClnc1進(jìn)行干擾或過表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)Smad3基因呈現(xiàn)顯著地反向變化趨勢(shì),兩者存在一種負(fù)向調(diào)控關(guān)系(分別上升至3.52±0.089和下降至0.50±0.026),Smad3蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與mRNA水平一致,同時(shí)結(jié)合RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾PGClnc1后會(huì)在磷酸化水平上對(duì)GAPDH的蛋白表達(dá)造成影響,進(jìn)而從蛋白水平上行使功能;然后針對(duì)性地對(duì)PGClnc1與miRNA的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合機(jī)制進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)PGClnc1和其cis預(yù)測(cè)的靶基因BTRC具有結(jié)合靶點(diǎn)的miRNA是gga-mir-6557-5p,將miRNA的模擬物與抑制物,與PGClnc1的干擾過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn),干擾PGClnc1,靶基因表達(dá)下調(diào)至0.257±0.020;過表達(dá)miR,BTRC表達(dá)下調(diào)至0.566±0.019。干擾BTRC,PGClnc1表達(dá)下調(diào)至0.788±0.031;過表達(dá)miR,PGClnc1表達(dá)下調(diào)至0.574±0.025,而過表達(dá)PGClnc1,過表達(dá)miR,BTRC表達(dá)上調(diào)至 1.257±0.028。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S831
【部分圖文】：

圖２－１邋ＩｎｃＲＮＡ篩選流程圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋ＩｎｃＲＮＡ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑１．４．４．４．１基本師選逡逑

ｉｓ邋ｎｏ邋ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．逡逑２．５邋ＲＮＡ－ｓｅｑ整體質(zhì)量評(píng)估逡逑通過比較不同樣品之間定量結(jié)果的箱形圖和密度分布圖（圖２－５、圖２－６），直觀觀察到各逡逑組樣品整體表達(dá)水平上的差異，本研宄對(duì)ＥＳＣｓ、ＰＧＣｓ、ＳＳＣｓ、ＣＥＦｓ四種樣本，對(duì)每種樣品逡逑的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)每種樣本的ＦＰＫＭ值，利用箱型圖和密度分布圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)呈現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)逡逑每種樣本的整體數(shù)據(jù)的表達(dá)量符合ｌ0ｇｌ0（ＦＰＢＣＭ＋ｌ）＞０，可用于后續(xù)的分析篩選。逡逑ＦＰＫＭ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ逡逑６－邋：邋８逡逑＾邋Ｊ邐：邐：逡逑ｇ邐；邐丨邐：邐Ｇｒｏｕｐ逡逑＾４＂邐Ｉ邐白邋ＥＳＣｓ逡逑ｇ－邐串邋ＰＧＣｓ逡逑５＾邐§ＣＥＦ逡逑0）邐＾ＳＳＣｓ逡逑－２逡逑２－逡逑Ｉ…邐１逡逑邐邋邐逡逑０－邋邐邋￣Ｉ￣邋邋１邋邋￣Ｉ￣￣逡逑＜＾＞邋＜＾＞邐＾邐＜§＞逡逑圖２－５邋ＦＰＫＭ箱型圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋ＦＰＫＭ邋ｂｏｘ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑注：本研究利用的ＦＰＫＭ是每百萬ｆｒａｇｍｅｎｔｓ中來自某一基因每千械基長(zhǎng)度的ｆｒａｇｍｅｎｔｓ數(shù)目，其同時(shí)考慮逡逑了測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)ｆｒａｇｍｅｎｔｓ計(jì)數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法。橫坐標(biāo)為樣品逡逑名稱，縱坐標(biāo)為ｌｏｇｌ０（ＦＰＫＭ＋ｌ），每個(gè)區(qū)域的箱型圖對(duì)五個(gè)統(tǒng)計(jì)量（至上而下分別為最大值，上四分位數(shù)，逡逑中值

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2834058