新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一種有囊膜、含有單股負(fù)鏈不分節(jié)段基因組的RNA病毒,其基因組至少編碼六種病毒蛋白。基質(zhì)蛋白(matrix protein,M)是NDV基因組編碼的一種非糖基化膜相關(guān)蛋白,位于病毒囊膜內(nèi)表面,構(gòu)成病毒核衣殼蛋白和囊膜連接的支架。與大多數(shù)副黏病毒M蛋白一樣,NDV M蛋白是一種多功能病毒蛋白,同時(shí)也是一種細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白。本課題組前期通過熒光共定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)importinβ1蛋白缺失體與NDV M蛋白共表達(dá)后導(dǎo)致M蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞核,并且免疫共沉淀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)importinβ1蛋白能與M蛋白發(fā)生相互作用,暗示importinβ1蛋白可能是NDV M蛋白入核轉(zhuǎn)運(yùn)的核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白。由于免疫共沉淀試驗(yàn)不能反映蛋白之間的直接相互作用,因此需要進(jìn)一步用其它試驗(yàn)來驗(yàn)證。目前,pull-down技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)之間在體外的直接相互作用研究。因此,本研究通過構(gòu)建NDV M基因和雞importinβ1基因的重組原核表達(dá)載體,利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白,然后通過GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證NDV M蛋白與雞importinβ1蛋白之間的相互作用。1雞importinβ1基因的克隆與序列分析根據(jù)Gen Bank登錄的雞importinβ1基因序列(XM_015299473)設(shè)計(jì)合成特異性引物,通過RT-PCR從DF-1細(xì)胞中擴(kuò)增importinβ1基因CDS區(qū)并進(jìn)行克隆和測(cè)序,利用生物信息學(xué)工具對(duì)其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位和系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。結(jié)果表明,雞importinβ1基因CDS全長(zhǎng)2268 bp,共編碼755個(gè)氨基酸,編碼的蛋白等電點(diǎn)為4.61,相對(duì)分子質(zhì)量84.15 k Da,分子式為C3712H5901N979O1152S46。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,雞importinβ1蛋白含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu),以α螺旋為主(占64.90%),亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。importinβ1基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明雞與鵪鶉的親緣關(guān)系最近。2雞importinβ1基因重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)本研究以重組質(zhì)粒p CR2.1-importinβ1為模板,用雞importinβ1基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,膠回收目的基因并將其亞克隆至原核表達(dá)載體p ET-32a(+),構(gòu)建重組原核表達(dá)載體p ET-32a-importinβ1。將測(cè)序正確的重組原核表達(dá)載體p ET-32a-importinβ1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,以確定重組蛋白的最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明,成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體p ET-32a-importinβ1,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化,確定當(dāng)IPTG終濃度0.1m M、溫度37℃、誘導(dǎo)時(shí)間4h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高,并且在大腸桿菌中的目的蛋白分子量約為97 k Da,與預(yù)期大小相一致。對(duì)目的蛋白表達(dá)形式研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),His-importinβ1重組蛋白以可溶性和包涵體形式存在。3 NDV M基因重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒p CMV-HA-M為模板,利用NDV M基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,膠回收目的基因后進(jìn)行雙酶切,然后將其與經(jīng)過同樣雙酶切的原核表達(dá)載體p GEX-6p-1連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,以此構(gòu)建重組原核表達(dá)載體p GEX-6p-M。將測(cè)序正確的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,以確定最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明,成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體p GEX-6p-M,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化,確定當(dāng)IPTG終濃度0.1m M、溫度37℃、誘導(dǎo)時(shí)間5h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高,并且在大腸桿菌中的目的蛋白分子量約為68 k Da,與預(yù)期大小相一致。對(duì)目的蛋白表達(dá)形式研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),GST-M重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。4 GST Pull-down驗(yàn)證NDV M蛋白與雞importinβ1蛋白的相互作用本研究對(duì)包涵體GST-M重組蛋白首先進(jìn)行變性和復(fù)性處理,以獲得有活性的GST-M重組蛋白。然后以GST-M重組蛋白為誘餌蛋白,His-importinβ1重組蛋白為獵物蛋白,利用GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證M蛋白與importinβ1蛋白的相互作用。結(jié)果表明,利用蛋白重折疊試劑盒獲得了有活性的GST-M重組蛋白,將其作為誘餌蛋白,可以捕獲并檢測(cè)到His-importinβ1重組蛋白,但是GST標(biāo)簽蛋白不能結(jié)合His-importinβ1重組蛋白。以上結(jié)果說明GST pull-down技術(shù)證實(shí)NDV M蛋白與雞importinβ1蛋白在體外具有直接的相互作用,這為深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白細(xì)胞核定位的分子機(jī)制以及在NDV復(fù)制和致病中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

圖 1 不同物種 importin β1 蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structure scheme of importin β1 of different species目前，國內(nèi)外對(duì)人類 importin β1 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究較為深入。在第 21~101 位氨基酸區(qū)域?yàn)?IBN_N 結(jié)構(gòu)域，可以與 Ras 相關(guān)蛋白（ras related nuclear protein，Ran）結(jié)合；而第 2~873 位氨基酸區(qū)域包含 18 個(gè) HEAT 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可形成 2 種α-螺旋結(jié)構(gòu)（A 螺旋和 B 螺旋）（圖 2），其作用是通過伸展或收縮改變其構(gòu)象，為與其它細(xì)胞蛋白或病毒蛋白的相互作用提供豐富的結(jié)合位點(diǎn)（Tauchert MJ, et al, 2016）。雖然importin β1 基因被認(rèn)為是“管家基因”，但它并不在人類的所有組織中均勻表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，importin β1 基因在積極增殖的組織，如腫瘤、睪丸、干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等顯現(xiàn)出相對(duì)高的表達(dá)；利用 MAPPER 計(jì)算工具預(yù)測(cè)的特化蛋白 1(specificity protein 1，SP1)、核因子 E2 相關(guān)因子 2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, NRF-2)、環(huán)-螺旋蛋白1(helix-loop-helix protein 1, HLH-1)、Ras 應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 1(ras responsive elementbinding protein 1, RREB-1)、CAAT 框(CAAT box)等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 結(jié) 合 位 點(diǎn) 可 能

經(jīng)典和非經(jīng)典 NLS 序列及其三維結(jié)構(gòu)圖（根據(jù)參考文獻(xiàn)修改，Lott K, et he amino acid sequences and three-dimensional structures of classical and non-(modified from reference, Lott K, et al, 2011)明，importin β1 蛋白結(jié)合靶蛋白在穿過 NPC 的過程中還需要 R, et al, 2015; Raices M, et al, 2017）。Ran 是一種小 G 蛋白，在細(xì)調(diào)節(jié)因子 1(regulator of chromosome condensation 1, RCC1)、Ran GTPase activating protein, RanGAP) 等共同調(diào)控 importin β1 介導(dǎo)佩偉，等，2011）。隨著研究的深入，importin β1 直接介導(dǎo)的靶漸清晰，其具體過程如圖 4 所示（Harel A, et al, 2004）：在細(xì)胞1 識(shí)別靶蛋白 NLS 并結(jié)合形成 importin β1-靶蛋白二元復(fù)合物，接基與 RanGDP 結(jié)合形成靶蛋白-importin β1-RanGDP 三元復(fù)合物復(fù)合物中的 RanGDP 與 NPC 上的核孔蛋白 NTF2 結(jié)合，導(dǎo)致 NP細(xì)胞核外側(cè)的核孔蛋白變位到細(xì)胞核內(nèi)側(cè)，這時(shí)與核孔蛋白結(jié)合

2018 屆碩士研究生學(xué)位論文靶蛋白留在細(xì)胞核內(nèi)，importin β1-RanGDP 中的 RanGDP 在染色體濃縮調(diào)節(jié)因子 RCC1作用下，又被 RanGTP 替代形成 importin β1-RanGTP 復(fù)合物，并穿過 NPC 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，importin β1-RanGTP 被 RanGAP 水解成 importin β1 和 RanGDP。此時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)中新合成的或解離出的 importin β1 和 RanGDP 等待新一輪靶蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明，理論上如果某蛋白能與核孔復(fù)合體上的 FG 重復(fù)序列結(jié)合，則該蛋白就能不依賴于 importinα/β而進(jìn)行入核轉(zhuǎn)運(yùn)，例如β-Catenin（Eun-Kyung Suh, et al, 2003）。在靶蛋白的入核轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，細(xì)胞內(nèi) importin β1 蛋白質(zhì)水平的升高多見于癌細(xì)胞（van der Watt PJ, et al, 2009; Angus L, et al, 2009），這是由于癌細(xì)胞增殖所需的貨物，如組蛋白、糖皮質(zhì)激素受體和 RNA 等需要 importin β1 給予大量轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，這一發(fā)現(xiàn)使得 importin β1 逐漸成為抗癌藥物新靶點(diǎn)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2834320