哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育是由一系列高度保守、可調(diào)控、可預(yù)測的細(xì)胞分裂等事件構(gòu)成的,主要包括:精卵結(jié)合形成受精卵、最初的胚胎細(xì)胞分裂(卵裂)、合子基因組激活(zygotic genome activation,ZGA),桑椹胚的致密化(compaction)和形成具有植入能力的囊胚(blastocyst)。其中單細(xì)胞的合子(zygote)迅速擴(kuò)張分化形成含有多細(xì)胞譜系的囊胚對于早期胚胎發(fā)育過程至關(guān)重要。豬是重要的肉用家畜,也是潛在的生物醫(yī)學(xué)模式動(dòng)物和人類異種器官移植的供體動(dòng)物。二十一世紀(jì)生命科學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展迅猛,干細(xì)胞和基因編輯理論與技術(shù)不斷取得突破。如何把這些前沿理論與技術(shù)成果早日應(yīng)用在豬的育種、醫(yī)學(xué)模型豬的構(gòu)建及異種器官移植供體的研制中是該領(lǐng)域科學(xué)家面對的重要挑戰(zhàn)。鑒于豬在疾病模型上的優(yōu)勢地位,更多的了解豬早期胚胎發(fā)育機(jī)制,以及突破豬干細(xì)胞建立的瓶頸是后續(xù)所有研究人員的重點(diǎn)工作�？v觀小鼠ESC建立的過程,想要在其他大型哺乳動(dòng)物上成功建立ESC還需要很長的探索之路,目前唯一能作為參考的只有早期胚胎,通過深度挖掘早期胚胎的發(fā)育機(jī)制能夠?yàn)樽罱K建立ESC提供強(qiáng)有力的理論支持,以便更好的推動(dòng)豬作為疾病模型的探索工作。因此,借助新興的技術(shù)手段來全面地解析豬早期胚胎的發(fā)育機(jī)制已迫在眉睫。與小鼠胚胎發(fā)育相比,豬胚胎著床前的發(fā)育時(shí)程長,胚胎發(fā)育的模式差別巨大,相關(guān)基礎(chǔ)研究不多,可供參考的文獻(xiàn)十分有限。過去,人們一直認(rèn)為非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,即“轉(zhuǎn)錄垃圾”,但是最近的一些研究已經(jīng)證明,這些ncRNAs并不是“轉(zhuǎn)錄垃圾”,而是真正發(fā)揮功能的分子。此外ncRNAs分子的數(shù)量與有機(jī)體的復(fù)雜性相關(guān),其對更加高等的動(dòng)物可能會有更重要的作用。而且ncRNAs已被證明在各個(gè)物種中保守性比編碼基因相對較弱,我們有理由懷疑ncRNAs會貢獻(xiàn)到豬的特異性基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。本研究借助于高通量轉(zhuǎn)錄組測序等先進(jìn)分子技術(shù),系統(tǒng)鑒定豬早期胚胎發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因及ncRNAs(內(nèi)源性小干擾RNA:endo-siRNAs;基因間長鏈非編碼RNA:lincRNAs),并揭示豬作為大型哺乳動(dòng)物代表的早期胚胎發(fā)育獨(dú)特的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具體研究結(jié)果如下:(1)準(zhǔn)備5×10~9個(gè)精子,7845個(gè)卵母細(xì)胞和6800個(gè)合子用于小RNA高通量測序,在豬的精子,卵母細(xì)胞和合子中分別獲得了90431,244480和219971個(gè)sncRNAs。通過自己建立的生物信息學(xué)方法第一次在豬配子及合子中對ncRNAs進(jìn)行分類,并鑒定了三種來源的endo-siRNAs:重復(fù)元件相關(guān)的內(nèi)源性小RNA(TE-siRNAs),長發(fā)卡結(jié)構(gòu)來源的內(nèi)源性小RNA(Lhp-siRNAs)和mRNA自身回折互補(bǔ)來源的內(nèi)源性小RNA(IC-siRNAs)。對合子和精子或卵母細(xì)胞之間的endo-siRNAs進(jìn)行了差異表達(dá)分析,重點(diǎn)研究對象為合子高表達(dá)的endo-siRNAs。深入分析顯示大部分高表達(dá)的endo-siRNAs被映射到豬L1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的ORF2和3'UTR區(qū)域,因此,我們將這些L1來源的特異性endo-siRNAs稱為L1-siRNAs。通過多重序列比對及RACE的方法,找到L1對應(yīng)的反義轉(zhuǎn)錄物:一個(gè)沒有注釋的長鏈非編碼RNA(asL1)。L1 ORF2和asL1之間可以形成365bp的雙鏈RNA結(jié)構(gòu),并證實(shí)了合子中高reads數(shù)的9個(gè)L1-siRNAs都映射到該區(qū)域。最后,通過干擾等實(shí)驗(yàn)手段,證實(shí)了L1-siRNAs通過抑制L1逆轉(zhuǎn)錄的活性來調(diào)控早期胚胎發(fā)育。這項(xiàng)工作可以證實(shí)豐富的endo-siRNAs在胚胎發(fā)育中的作用。(2)除人小鼠以外的大型哺乳動(dòng)物的早期胚胎單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜目前沒有報(bào)道。因此我們針對豬體內(nèi)早期胚胎單卵裂球進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,首創(chuàng)了一種針對豬的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層完整分離體系及單個(gè)細(xì)胞分離體系。最終對豬早期胚胎各個(gè)時(shí)期的單卵裂球共106個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過生物信息學(xué)分析揭示了豬早期胚胎宏觀轉(zhuǎn)錄圖譜隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化;確定了豬合子基因組激活發(fā)生在四細(xì)胞到八細(xì)胞時(shí)期;在桑椹胚中鑒定了73個(gè)參與調(diào)控卵裂球異質(zhì)性的關(guān)鍵候選基因;通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA),鑒定早期胚胎特定發(fā)育時(shí)期對應(yīng)的特異性基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后通過與人,小鼠,�；虮磉_(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較,揭示了相比于小鼠,豬等大動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能與小型動(dòng)物存在巨大的差別,挖掘出來許多豬的未進(jìn)行功能研究的新基因,這些新基因都貢獻(xiàn)到豬等大型哺乳動(dòng)物特異性基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,加深了人們對其的認(rèn)知。(3)由于豬的基因組注釋不完整,且以往測序數(shù)據(jù)深度不夠,無法挖掘出有功能但表達(dá)量很低的lncRNAs,導(dǎo)致豬lncRNAs的相關(guān)工作停滯不前。本研究中,我們利用10G數(shù)據(jù)量的測序深度,第一次在豬單個(gè)卵裂球中系統(tǒng)地預(yù)測了lncRNAs。利用非依賴序列注釋的編碼能力預(yù)測算法(CPAT,CNCI,PLEK)對候選轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行打分,共得到43303個(gè)轉(zhuǎn)錄本為最終的lincRNAs的轉(zhuǎn)錄本,對應(yīng)著18515個(gè)lincRNAs基因座。本研究預(yù)測得到的lincRNAs數(shù)量非常龐大,可以為研究lincRNAs的學(xué)者提供一個(gè)真正可參考的豬早期胚胎lincRNAs數(shù)據(jù)庫。此外對于lincRNAs來說,在四細(xì)胞期各個(gè)卵裂球就表現(xiàn)出了明顯的表達(dá)異質(zhì)性,也暗示了lincRNAs先于編碼基因表達(dá)出現(xiàn)異質(zhì)性,可能預(yù)示著lincRNAs可以參與調(diào)控編碼基因,從而造成隨后的編碼基因在各個(gè)卵裂球表達(dá)的異質(zhì)性。通過將lincRNAs與編碼基因融合在一起進(jìn)行WGCNA分析,我們得到許多發(fā)育各時(shí)期相關(guān)的lincRNAs,豐富了mRNA的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位論文6圖1-1 母源-合子過渡的特征[86]Figure 1-1 Characteristic features of the maternal-to-zygotic transition[86]1.1.2.1 哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)小鼠ZGA時(shí)期的特點(diǎn)主要是轉(zhuǎn)錄階段通常稱為“波”（Wave），許多基因似乎只在特定階段轉(zhuǎn)錄，而少數(shù)基因在整個(gè)植入前發(fā)育階段都具有轉(zhuǎn)錄活性[91]。在小鼠早期胚胎發(fā)育中，第一個(gè)胚胎轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第一個(gè)細(xì)胞周期的G2期的雄性原核中被檢測到[92]。受精后20h，雌雄原核開始融合并開始第一次細(xì)胞分裂。2-cell階段的轉(zhuǎn)錄是依賴于RNA聚合酶Ⅱ（RNAPII）的，并且是進(jìn)一步細(xì)胞分裂所必需的[93]。轉(zhuǎn)錄的第二階段發(fā)生在4-cell到8-cell轉(zhuǎn)換時(shí)期開始，標(biāo)志著形態(tài)變化的開始，最終形成囊胚[94]。由于哺乳動(dòng)物的早期胚胎需要植入接受營養(yǎng)

引 言9全面喪失，但保留在母本的基因組中（圖1-2），在顯微鏡[138]和分子水平[139]上也有相同的結(jié)果。圖1-2 體內(nèi)胚胎的表觀變化[140]Figure 1-2 Epigenetic changes during in vivo embryonicdevelopment[140]值得注意的是，胚胎基ZGA時(shí)間與表觀重編程同時(shí)進(jìn)行，其中雄性基因組更容易保持開放狀態(tài)從而轉(zhuǎn)錄在晚期合子階段，而在此后2-cell和4-cell階段的兩個(gè)基因組中的轉(zhuǎn)錄都增加[92, 141-143]。最近的證據(jù)表明，雄性基因組在早期合子中去甲基化的紊亂會擾亂幾個(gè)多能相關(guān)的父本等位基因的激活并且影響胚胎發(fā)育[144]。這表明可能需要不同的表觀遺傳程序在兩個(gè)親本基因組的順序激活過程中調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的表達(dá)。1.1.3.1 DNA甲基化在CpG雙核苷酸處的5-甲基胞嘧啶（5mC）修飾是最廣泛的DNA修飾，其與基因沉默有關(guān)。通過細(xì)胞分裂對這種修飾的遺傳是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1來實(shí)現(xiàn)的，該DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將該修飾復(fù)制到新合成的DNA鏈上。在Dnmt1缺乏活性的情況下

新的標(biāo)桿。此外，OCT4和CDX2分別是早期胚胎中ICM和TE的標(biāo)記共同調(diào)控ICM與TE的分化過程。但二者的互作模式在豬胚胎中是否與Bou等人通過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)在豬早期胚胎中過表達(dá)CDX2可導(dǎo)致胚胎；分子機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)CDX2在核內(nèi)競爭性結(jié)合相關(guān)位點(diǎn)，導(dǎo)致OCT4離終以蛋白酶體途徑被降解，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育的異常。這種CDX2對同于小鼠基于胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究建立起來的調(diào)控模式，性或者是物種特異性的調(diào)控模式。為缺乏干細(xì)胞的大型哺乳動(dòng)物胚胎現(xiàn)實(shí)可行的研究體系[179]。，干細(xì)胞已經(jīng)可以從早期胚胎的TE，PE，ICM和EPI中成功分離出來[需要特殊的培養(yǎng)條件來維持自我更新能力。小鼠的第一株胚胎干細(xì)胞小鼠的囊胚ICM中分離得到的[181, 182]。這些細(xì)胞形成的克隆看起來是并且可以在含有LIF并補(bǔ)充有FBS的培養(yǎng)基中增殖[183]。人的第一株ESC[184]。從人鼠以外的其他哺乳動(dòng)物物種中獲取ESC的嘗試過程相對較長從1990年開始并持續(xù)至今。人們對豬的干細(xì)胞的建立的摸索實(shí)驗(yàn)要明-3）。一般而言，這些細(xì)胞系的大部分也未能對嵌合體起作用，并且僅。最接近標(biāo)準(zhǔn)ES細(xì)胞系的是來自于Xue的報(bào)道，他們獲得了具有嵌合生成畸胎瘤的豬類ES細(xì)胞系[185]。然而目前為止還沒有真正具有生殖

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本文編號：2833095