哺乳動物早期胚胎發(fā)育是由一系列高度保守、可調控、可預測的細胞分裂等事件構成的,主要包括:精卵結合形成受精卵、最初的胚胎細胞分裂(卵裂)、合子基因組激活(zygotic genome activation,ZGA),桑椹胚的致密化(compaction)和形成具有植入能力的囊胚(blastocyst)。其中單細胞的合子(zygote)迅速擴張分化形成含有多細胞譜系的囊胚對于早期胚胎發(fā)育過程至關重要。豬是重要的肉用家畜,也是潛在的生物醫(yī)學模式動物和人類異種器官移植的供體動物。二十一世紀生命科學基礎研究的發(fā)展迅猛,干細胞和基因編輯理論與技術不斷取得突破。如何把這些前沿理論與技術成果早日應用在豬的育種、醫(yī)學模型豬的構建及異種器官移植供體的研制中是該領域科學家面對的重要挑戰(zhàn)。鑒于豬在疾病模型上的優(yōu)勢地位,更多的了解豬早期胚胎發(fā)育機制,以及突破豬干細胞建立的瓶頸是后續(xù)所有研究人員的重點工作。縱觀小鼠ESC建立的過程,想要在其他大型哺乳動物上成功建立ESC還需要很長的探索之路,目前唯一能作為參考的只有早期胚胎,通過深度挖掘早期胚胎的發(fā)育機制能夠為最終建立ESC提供強有力的理論支持,以便更好的推動豬作為疾病模型的探索工作。因此,借助新興的技術手段來全面地解析豬早期胚胎的發(fā)育機制已迫在眉睫。與小鼠胚胎發(fā)育相比,豬胚胎著床前的發(fā)育時程長,胚胎發(fā)育的模式差別巨大,相關基礎研究不多,可供參考的文獻十分有限。過去,人們一直認為非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)是轉錄的副產物,即“轉錄垃圾”,但是最近的一些研究已經證明,這些ncRNAs并不是“轉錄垃圾”,而是真正發(fā)揮功能的分子。此外ncRNAs分子的數量與有機體的復雜性相關,其對更加高等的動物可能會有更重要的作用。而且ncRNAs已被證明在各個物種中保守性比編碼基因相對較弱,我們有理由懷疑ncRNAs會貢獻到豬的特異性基因表達調控網絡中。本研究借助于高通量轉錄組測序等先進分子技術,系統(tǒng)鑒定豬早期胚胎發(fā)育相關調控基因及ncRNAs(內源性小干擾RNA:endo-siRNAs;基因間長鏈非編碼RNA:lincRNAs),并揭示豬作為大型哺乳動物代表的早期胚胎發(fā)育獨特的分子調控網絡。具體研究結果如下:(1)準備5×10~9個精子,7845個卵母細胞和6800個合子用于小RNA高通量測序,在豬的精子,卵母細胞和合子中分別獲得了90431,244480和219971個sncRNAs。通過自己建立的生物信息學方法第一次在豬配子及合子中對ncRNAs進行分類,并鑒定了三種來源的endo-siRNAs:重復元件相關的內源性小RNA(TE-siRNAs),長發(fā)卡結構來源的內源性小RNA(Lhp-siRNAs)和mRNA自身回折互補來源的內源性小RNA(IC-siRNAs)。對合子和精子或卵母細胞之間的endo-siRNAs進行了差異表達分析,重點研究對象為合子高表達的endo-siRNAs。深入分析顯示大部分高表達的endo-siRNAs被映射到豬L1逆轉錄轉座子的ORF2和3'UTR區(qū)域,因此,我們將這些L1來源的特異性endo-siRNAs稱為L1-siRNAs。通過多重序列比對及RACE的方法,找到L1對應的反義轉錄物:一個沒有注釋的長鏈非編碼RNA(asL1)。L1 ORF2和asL1之間可以形成365bp的雙鏈RNA結構,并證實了合子中高reads數的9個L1-siRNAs都映射到該區(qū)域。最后,通過干擾等實驗手段,證實了L1-siRNAs通過抑制L1逆轉錄的活性來調控早期胚胎發(fā)育。這項工作可以證實豐富的endo-siRNAs在胚胎發(fā)育中的作用。(2)除人小鼠以外的大型哺乳動物的早期胚胎單細胞轉錄組圖譜目前沒有報道。因此我們針對豬體內早期胚胎單卵裂球進行轉錄組測序,首創(chuàng)了一種針對豬的內細胞團和滋養(yǎng)層完整分離體系及單個細胞分離體系。最終對豬早期胚胎各個時期的單卵裂球共106個樣本進行轉錄組測序。通過生物信息學分析揭示了豬早期胚胎宏觀轉錄圖譜隨著胚胎發(fā)育的進行而發(fā)生動態(tài)變化;確定了豬合子基因組激活發(fā)生在四細胞到八細胞時期;在桑椹胚中鑒定了73個參與調控卵裂球異質性的關鍵候選基因;通過加權基因共表達網絡分析(WGCNA),鑒定早期胚胎特定發(fā)育時期對應的特異性基因表達調控網絡;最后通過與人,小鼠,牛基因表達調控網絡進行比較,揭示了相比于小鼠,豬等大動物的早期胚胎發(fā)育調控網絡可能與小型動物存在巨大的差別,挖掘出來許多豬的未進行功能研究的新基因,這些新基因都貢獻到豬等大型哺乳動物特異性基因表達調控網絡中,加深了人們對其的認知。(3)由于豬的基因組注釋不完整,且以往測序數據深度不夠,無法挖掘出有功能但表達量很低的lncRNAs,導致豬lncRNAs的相關工作停滯不前。本研究中,我們利用10G數據量的測序深度,第一次在豬單個卵裂球中系統(tǒng)地預測了lncRNAs。利用非依賴序列注釋的編碼能力預測算法(CPAT,CNCI,PLEK)對候選轉錄本進行打分,共得到43303個轉錄本為最終的lincRNAs的轉錄本,對應著18515個lincRNAs基因座。本研究預測得到的lincRNAs數量非常龐大,可以為研究lincRNAs的學者提供一個真正可參考的豬早期胚胎lincRNAs數據庫。此外對于lincRNAs來說,在四細胞期各個卵裂球就表現出了明顯的表達異質性,也暗示了lincRNAs先于編碼基因表達出現異質性,可能預示著lincRNAs可以參與調控編碼基因,從而造成隨后的編碼基因在各個卵裂球表達的異質性。通過將lincRNAs與編碼基因融合在一起進行WGCNA分析,我們得到許多發(fā)育各時期相關的lincRNAs,豐富了mRNA的表達調控網絡。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

東北農業(yè)大學理學博士學位論文6圖1-1 母源-合子過渡的特征[86]Figure 1-1 Characteristic features of the maternal-to-zygotic transition[86]1.1.2.1 哺乳動物轉錄動力學小鼠ZGA時期的特點主要是轉錄階段通常稱為“波”（Wave），許多基因似乎只在特定階段轉錄，而少數基因在整個植入前發(fā)育階段都具有轉錄活性[91]。在小鼠早期胚胎發(fā)育中，第一個胚胎轉錄產物在第一個細胞周期的G2期的雄性原核中被檢測到[92]。受精后20h，雌雄原核開始融合并開始第一次細胞分裂。2-cell階段的轉錄是依賴于RNA聚合酶Ⅱ（RNAPII）的，并且是進一步細胞分裂所必需的[93]。轉錄的第二階段發(fā)生在4-cell到8-cell轉換時期開始，標志著形態(tài)變化的開始，最終形成囊胚[94]。由于哺乳動物的早期胚胎需要植入接受營養(yǎng)

引 言9全面喪失，但保留在母本的基因組中（圖1-2），在顯微鏡[138]和分子水平[139]上也有相同的結果。圖1-2 體內胚胎的表觀變化[140]Figure 1-2 Epigenetic changes during in vivo embryonicdevelopment[140]值得注意的是，胚胎基ZGA時間與表觀重編程同時進行，其中雄性基因組更容易保持開放狀態(tài)從而轉錄在晚期合子階段，而在此后2-cell和4-cell階段的兩個基因組中的轉錄都增加[92, 141-143]。最近的證據表明，雄性基因組在早期合子中去甲基化的紊亂會擾亂幾個多能相關的父本等位基因的激活并且影響胚胎發(fā)育[144]。這表明可能需要不同的表觀遺傳程序在兩個親本基因組的順序激活過程中調節(jié)關鍵基因的表達。1.1.3.1 DNA甲基化在CpG雙核苷酸處的5-甲基胞嘧啶（5mC）修飾是最廣泛的DNA修飾，其與基因沉默有關。通過細胞分裂對這種修飾的遺傳是通過DNA甲基轉移酶Dnmt1來實現的，該DNA甲基轉移酶將該修飾復制到新合成的DNA鏈上。在Dnmt1缺乏活性的情況下

新的標桿。此外，OCT4和CDX2分別是早期胚胎中ICM和TE的標記共同調控ICM與TE的分化過程。但二者的互作模式在豬胚胎中是否與Bou等人通過系統(tǒng)研究發(fā)現在豬早期胚胎中過表達CDX2可導致胚胎；分子機制探索發(fā)現CDX2在核內競爭性結合相關位點，導致OCT4離終以蛋白酶體途徑被降解，從而導致胚胎發(fā)育的異常。這種CDX2對同于小鼠基于胚胎干細胞和滋養(yǎng)層干細胞研究建立起來的調控模式，性或者是物種特異性的調控模式。為缺乏干細胞的大型哺乳動物胚胎現實可行的研究體系[179]。，干細胞已經可以從早期胚胎的TE，PE，ICM和EPI中成功分離出來[需要特殊的培養(yǎng)條件來維持自我更新能力。小鼠的第一株胚胎干細胞小鼠的囊胚ICM中分離得到的[181, 182]。這些細胞形成的克隆看起來是并且可以在含有LIF并補充有FBS的培養(yǎng)基中增殖[183]。人的第一株ESC[184]。從人鼠以外的其他哺乳動物物種中獲取ESC的嘗試過程相對較長從1990年開始并持續(xù)至今。人們對豬的干細胞的建立的摸索實驗要明-3）。一般而言，這些細胞系的大部分也未能對嵌合體起作用，并且僅。最接近標準ES細胞系的是來自于Xue的報道，他們獲得了具有嵌合生成畸胎瘤的豬類ES細胞系[185]。然而目前為止還沒有真正具有生殖

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本文編號：2833095