豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)作為一種豬病毒性傳染病,其病原為PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)。目前PRRS在全世界的豬場廣泛流行傳播,造成了巨大的經(jīng)濟損失。2006年,我國突然爆發(fā)了豬高熱病,其臨床癥狀主要為持續(xù)高熱,迅速死亡,傳染性非常強,發(fā)病率接近100%,同時引起妊娠母豬嚴重流產(chǎn)等繁殖障礙,對我國養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了巨大危害,該病病原隨后被鑒定為高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV),該毒株是一種變異的PRRSV毒株。對于PRRSV的防控與凈化目前還沒有很好的方法,鑒于天然免疫在抗病毒過程中起著重要作用,因此需要進一步闡明其免疫機制,從而為該病的有效防控奠定基礎。病毒感染宿主后,機體的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)會迅速識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信號通路從而誘導干擾素(interferon,IFN),以及下游干擾素誘導基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的大量產(chǎn)生,進而起到抗病毒作用。由于PRRSV具有免疫抑制的特性,之前的研究主要圍繞在PRRSV蛋白對固有免疫的抑制效應及其機制,關于PRRSV如何被機體識別,以及誘導IFN產(chǎn)生的機制研究較少。本論文針對此問題進行了研究,取得的主要結果如下:1、本研究首先采用RNA結合蛋白免疫沉淀及測序(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation sequence,RIP-seq)等實驗方法分析了PRRSV感染豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophage,PAM)過程中,PRRSV基因組被黑色素瘤分化相關基因5(MDA5)和視黃酸誘導基因I(RIG-I)識別的堿基序列,結果表明在PRRSV感染的PAM中,RIG-I和MDA5主要結合于PRRSV正鏈基因組的3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated regions,3’UTR),同時RIG-I和MDA5的結合有U/C和U/G堿基序列特異性。2、PRRSV屬于套式病毒目,其基因組和亞基因組都含有共同的5’和3’UTR區(qū)域,對病毒的復制至關重要,同時本研究前期RIP-seq結果已證明,PRRSV 3’UTR區(qū)域?qū)τ诿庖咦R別非常重要,因此我們進一步研究了PRRSV基因組5’和3’UTR與免疫識別之間的關系。結果表明,PRRSV基因組的5’和3’UTR能夠刺激細胞產(chǎn)生IFN,并且位于PRRSV基因組3’UTR的假結結構能夠作為一種新的PAMP被模式識別受體RIG-I和Toll樣受體3(Toll like receptor 3,TLR3)識別,從而強烈地誘導IFN及ISGs的產(chǎn)生。由于假結結構是RNA病毒末端兩個莖環(huán)相互作用形成的三級結構,能作為分子開關調(diào)節(jié)病毒RNA合成以及病毒復制,本研究發(fā)現(xiàn)此假結結構還能作為PAMP誘導抗病毒免疫應答,且將此假結結構相互作用破壞后其誘導IFN的能力顯著降低。RNA-pull-down結果顯示,RIG-I的調(diào)節(jié)區(qū)(regulation domain,RD)和TLR3的腔內(nèi)區(qū)(ectodomain,ECD)均能與PRRSV基因組3’UTR的假結結構RNA結合。在PAM中轉(zhuǎn)染此假結結構能顯著抑制PRRSV復制,表明該結構具有抗病毒能力。序列比對及二級結構預測顯示,動脈炎病毒科其它成員在基因組3’UTR都含有假結結構,此結構在動脈炎病毒科中非常保守,且這些病毒基因組的假結結構都能有效誘導IFN產(chǎn)生。3、對豬源RIG-I的RD區(qū)(pRIG-I-RD)進行了表達和純化,并采用凝膠過濾層析驗證了pRIG-I-RD和PRRSV基因組3’UTR假結結構RNA的相互作用。同時本實驗采用小角散射(Small-angle X ray scattering,SAXS)技術分析了PRRSV 3’UTR假結結構RNA與pRIG-I-RD復合物在溶液中的狀態(tài),結果顯示其為細長的大分子結構,可能含有多個區(qū)域,至少有兩個中心。由于PRRSV基因組的5’末端帶有帽子,其識別機制與之前報道的機制不同,因此本研究為深入研究RIG-I識別模式奠定了基礎。綜上所述,本研究鑒定了3’UTR的假結結構可以作為病原相關分子模式特異性激活RIG-I和TLR3介導抗病毒免疫應答,并且該模式在動脈炎病毒科中非常保守。結合以往研究,我們提出了一個PRRSV基因組3’UTR假結結構誘導IFN效應與PRRSV蛋白抑制IFN效應平衡的模型。在早期胞內(nèi)體中,病毒基因組釋放到細胞質(zhì)內(nèi),基因組mRNA可以作為模板翻譯復制轉(zhuǎn)錄酶蛋白(polyprotein precursors 1 a,pp1a)(polyprotein precursors 1 ab,pp1ab),經(jīng)過切割后這些蛋白組裝成復制轉(zhuǎn)錄復合體(replication and transcription complex,RTC),然后結合到PRRSV 3’UTR區(qū)域起始負鏈RNA合成。在PRRSV復制過程中,PRRSV基因組3’UTR假結結構能夠被模式識別受體RIG-I的RD區(qū)和TLR3的ECD區(qū)識別并激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)或干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)產(chǎn)生IFN。病毒的蛋白例如非結構蛋白1/2/4/11(nonstructural proteins 1/2/4/11,NSP1/2/4/11)和結構蛋白N蛋白可以通過靶向IRF3或NF-κB從而干擾宿主的抗病毒應答。因此,PRRSV基因組3’UTR假結結構既能作為分子開關調(diào)節(jié)病毒RNA合成,同時可以影響天然免疫識別以及下游IFN產(chǎn)生。本研究為探索PRRSV免疫識別機制及發(fā)現(xiàn)RIG-I和MDA5新的識別特征奠定了重要研究基礎。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 1-1 PRRSV 顆粒在電子顯微鏡下的形態(tài)（引自 (Dokland et al., 2010)）1-1 Electron microscopy description of PRRSV virions (cited from (Dokland et al., 1-2 所示，在 PRRSV 復制和翻譯過程中，由 ORF2-7 基因組序列產(chǎn)生，所有的亞基因組 RNA 含有共同的 3’ UTR 區(qū)域，同時其 5’端含有源于 PRRSV 基因組的 5’ UTR 部分區(qū)域，且該區(qū)域含有重要的轉(zhuǎn)錄共同 5’端和 3’端的亞基因組 RNA 是由病毒的非連續(xù)型復制方et al. 2007)，其編碼 PRRSV 的結構蛋白 GP2/3/4/5、M 蛋白和 N 蛋白 RNA 的過程中首先要以 PRRSV 基因組為模板合成負鏈亞基因組 Ric RNA，（-）sgRNA），在負鏈亞基因組 RNA 的 3’末端區(qū)域含有一NA 上的 TRS 互補的反向前導序列，在產(chǎn)生亞基因組過程中，此序列續(xù)移動與正鏈基因組的 TRS 序列互補，從而形成不同的負鏈亞基t al. 2013)。SV 基因組 RNA 3’ UTR 末端發(fā)卡結構是病毒 RNA 合成所必需的，并環(huán)狀區(qū)域相互作用形成假結結構 (Beerens et al. 2007b)，此假結結構毒中非常保守，作為分子開關調(diào)節(jié)負鏈 RNA 合成。此外，PRRSV

第一章 文獻綜述 聚復制聚合酶蛋白前體 (Meulenberg et al. 1993)。這兩個多聚復制聚合酶蛋白前體特定的蛋白酶裂解從而產(chǎn)生至少 14 個具有不同結構和功能的 NSPs。由 ORF1a 開讀框編碼的非結構蛋白主要包括 6 個蛋白即 NSP1α/1β/2/3/4/5，而由 ORF1b 開放閱編碼的非結構蛋白主要包括 4 個蛋白即 NSP9-12。將 pp1a 和 pp1ab 進行加工的蛋主要位于NSP1α、NSP1β、NSP2和NSP4上 (Dea et al. 2000; Snijder et al. 1998)。PRRTC 的形成依賴于這些非結構蛋白的正確翻譯及組裝，組裝成功的 RTC 圍繞在內(nèi)質(zhì)近，進一步進行基因組的復制和病毒顆粒的組裝，包括亞基因組的合成及翻譯，產(chǎn)條編碼不同結構蛋白的亞基因組，在亞基因組的序列兩端存在共同的非編碼區(qū) 5’和度分別為 190-220 nt 和 150 nt，其對亞基因組的翻譯過程至關重要，亞基因組進一成病毒顆粒組裝所需的結構蛋白 (de Vries et al. 1990; Kroese et al. 2008)。

圖 1-4 PRRSV 膜蛋白相互作用（引自 (Das et a1．，2010)）he PRRSV envelope protein complex of PRRSV (cited from (Das et a1顆粒的組裝，目前認為最主要的蛋白是 GP5、M 和 N 蛋白使病毒正確組裝。有研究報道 GP2a/3/4 和 E 蛋白是病毒感毒形成的重要蛋白，但是也會參與病毒組裝，這四個蛋白在，表達在病毒表面，缺一不可。另外這個多元復合物中糖蛋體 CD163 相互作用，對于病毒入侵至關重要 (Das et al. 20蛋白，GP5 和 M 蛋白作為外源物質(zhì)對于宿主免疫反應有強亞單位疫苗的開發(fā) (Pirzadeh et al. 1998)。同時，研究發(fā)現(xiàn) 聯(lián)表達后，其對于宿主細胞的免疫刺激效應顯著增強，GP白但是其可以與 GP5 協(xié)同作用從而增強機體的抗病毒免疫預防和控制臨床上引起嚴重的經(jīng)濟損失，因此自此病出現(xiàn)以來，關于止過，常規(guī)的疫苗類型分為將 PRRSV 滅活的滅活疫苗和將

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本文編號：2832984