豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)作為一種豬病毒性傳染病,其病原為PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)。目前PRRS在全世界的豬場廣泛流行傳播,造成了巨大的經(jīng)濟損失。2006年,我國突然爆發(fā)了豬高熱病,其臨床癥狀主要為持續(xù)高熱,迅速死亡,傳染性非常強,發(fā)病率接近100%,同時引起妊娠母豬嚴重流產(chǎn)等繁殖障礙,對我國養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了巨大危害,該病病原隨后被鑒定為高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV),該毒株是一種變異的PRRSV毒株。對于PRRSV的防控與凈化目前還沒有很好的方法,鑒于天然免疫在抗病毒過程中起著重要作用,因此需要進一步闡明其免疫機制,從而為該病的有效防控奠定基礎(chǔ)。病毒感染宿主后,機體的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)會迅速識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信號通路從而誘導(dǎo)干擾素(interferon,IFN),以及下游干擾素誘導(dǎo)基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的大量產(chǎn)生,進而起到抗病毒作用。由于PRRSV具有免疫抑制的特性,之前的研究主要圍繞在PRRSV蛋白對固有免疫的抑制效應(yīng)及其機制,關(guān)于PRRSV如何被機體識別,以及誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的機制研究較少。本論文針對此問題進行了研究,取得的主要結(jié)果如下:1、本研究首先采用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀及測序(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation sequence,RIP-seq)等實驗方法分析了PRRSV感染豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophage,PAM)過程中,PRRSV基因組被黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)和視黃酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)識別的堿基序列,結(jié)果表明在PRRSV感染的PAM中,RIG-I和MDA5主要結(jié)合于PRRSV正鏈基因組的3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated regions,3’UTR),同時RIG-I和MDA5的結(jié)合有U/C和U/G堿基序列特異性。2、PRRSV屬于套式病毒目,其基因組和亞基因組都含有共同的5’和3’UTR區(qū)域,對病毒的復(fù)制至關(guān)重要,同時本研究前期RIP-seq結(jié)果已證明,PRRSV 3’UTR區(qū)域?qū)τ诿庖咦R別非常重要,因此我們進一步研究了PRRSV基因組5’和3’UTR與免疫識別之間的關(guān)系。結(jié)果表明,PRRSV基因組的5’和3’UTR能夠刺激細胞產(chǎn)生IFN,并且位于PRRSV基因組3’UTR的假結(jié)結(jié)構(gòu)能夠作為一種新的PAMP被模式識別受體RIG-I和Toll樣受體3(Toll like receptor 3,TLR3)識別,從而強烈地誘導(dǎo)IFN及ISGs的產(chǎn)生。由于假結(jié)結(jié)構(gòu)是RNA病毒末端兩個莖環(huán)相互作用形成的三級結(jié)構(gòu),能作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)病毒RNA合成以及病毒復(fù)制,本研究發(fā)現(xiàn)此假結(jié)結(jié)構(gòu)還能作為PAMP誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答,且將此假結(jié)結(jié)構(gòu)相互作用破壞后其誘導(dǎo)IFN的能力顯著降低。RNA-pull-down結(jié)果顯示,RIG-I的調(diào)節(jié)區(qū)(regulation domain,RD)和TLR3的腔內(nèi)區(qū)(ectodomain,ECD)均能與PRRSV基因組3’UTR的假結(jié)結(jié)構(gòu)RNA結(jié)合。在PAM中轉(zhuǎn)染此假結(jié)結(jié)構(gòu)能顯著抑制PRRSV復(fù)制,表明該結(jié)構(gòu)具有抗病毒能力。序列比對及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,動脈炎病毒科其它成員在基因組3’UTR都含有假結(jié)結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)在動脈炎病毒科中非常保守,且這些病毒基因組的假結(jié)結(jié)構(gòu)都能有效誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生。3、對豬源RIG-I的RD區(qū)(pRIG-I-RD)進行了表達和純化,并采用凝膠過濾層析驗證了pRIG-I-RD和PRRSV基因組3’UTR假結(jié)結(jié)構(gòu)RNA的相互作用。同時本實驗采用小角散射(Small-angle X ray scattering,SAXS)技術(shù)分析了PRRSV 3’UTR假結(jié)結(jié)構(gòu)RNA與pRIG-I-RD復(fù)合物在溶液中的狀態(tài),結(jié)果顯示其為細長的大分子結(jié)構(gòu),可能含有多個區(qū)域,至少有兩個中心。由于PRRSV基因組的5’末端帶有帽子,其識別機制與之前報道的機制不同,因此本研究為深入研究RIG-I識別模式奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究鑒定了3’UTR的假結(jié)結(jié)構(gòu)可以作為病原相關(guān)分子模式特異性激活RIG-I和TLR3介導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答,并且該模式在動脈炎病毒科中非常保守。結(jié)合以往研究,我們提出了一個PRRSV基因組3’UTR假結(jié)結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)IFN效應(yīng)與PRRSV蛋白抑制IFN效應(yīng)平衡的模型。在早期胞內(nèi)體中,病毒基因組釋放到細胞質(zhì)內(nèi),基因組mRNA可以作為模板翻譯復(fù)制轉(zhuǎn)錄酶蛋白(polyprotein precursors 1 a,pp1a)(polyprotein precursors 1 ab,pp1ab),經(jīng)過切割后這些蛋白組裝成復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(replication and transcription complex,RTC),然后結(jié)合到PRRSV 3’UTR區(qū)域起始負鏈RNA合成。在PRRSV復(fù)制過程中,PRRSV基因組3’UTR假結(jié)結(jié)構(gòu)能夠被模式識別受體RIG-I的RD區(qū)和TLR3的ECD區(qū)識別并激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)或干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)產(chǎn)生IFN。病毒的蛋白例如非結(jié)構(gòu)蛋白1/2/4/11(nonstructural proteins 1/2/4/11,NSP1/2/4/11)和結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白可以通過靶向IRF3或NF-κB從而干擾宿主的抗病毒應(yīng)答。因此,PRRSV基因組3’UTR假結(jié)結(jié)構(gòu)既能作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)病毒RNA合成,同時可以影響天然免疫識別以及下游IFN產(chǎn)生。本研究為探索PRRSV免疫識別機制及發(fā)現(xiàn)RIG-I和MDA5新的識別特征奠定了重要研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 1-1 PRRSV 顆粒在電子顯微鏡下的形態(tài)（引自 (Dokland et al., 2010)）1-1 Electron microscopy description of PRRSV virions (cited from (Dokland et al., 1-2 所示，在 PRRSV 復(fù)制和翻譯過程中，由 ORF2-7 基因組序列產(chǎn)生，所有的亞基因組 RNA 含有共同的 3’ UTR 區(qū)域，同時其 5’端含有源于 PRRSV 基因組的 5’ UTR 部分區(qū)域，且該區(qū)域含有重要的轉(zhuǎn)錄共同 5’端和 3’端的亞基因組 RNA 是由病毒的非連續(xù)型復(fù)制方et al. 2007)，其編碼 PRRSV 的結(jié)構(gòu)蛋白 GP2/3/4/5、M 蛋白和 N 蛋白 RNA 的過程中首先要以 PRRSV 基因組為模板合成負鏈亞基因組 Ric RNA，（-）sgRNA），在負鏈亞基因組 RNA 的 3’末端區(qū)域含有一NA 上的 TRS 互補的反向前導(dǎo)序列，在產(chǎn)生亞基因組過程中，此序列續(xù)移動與正鏈基因組的 TRS 序列互補，從而形成不同的負鏈亞基t al. 2013)。SV 基因組 RNA 3’ UTR 末端發(fā)卡結(jié)構(gòu)是病毒 RNA 合成所必需的，并環(huán)狀區(qū)域相互作用形成假結(jié)結(jié)構(gòu) (Beerens et al. 2007b)，此假結(jié)結(jié)構(gòu)毒中非常保守，作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)負鏈 RNA 合成。此外，PRRSV

第一章 文獻綜述 聚復(fù)制聚合酶蛋白前體 (Meulenberg et al. 1993)。這兩個多聚復(fù)制聚合酶蛋白前體特定的蛋白酶裂解從而產(chǎn)生至少 14 個具有不同結(jié)構(gòu)和功能的 NSPs。由 ORF1a 開讀框編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白主要包括 6 個蛋白即 NSP1α/1β/2/3/4/5，而由 ORF1b 開放閱編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白主要包括 4 個蛋白即 NSP9-12。將 pp1a 和 pp1ab 進行加工的蛋主要位于NSP1α、NSP1β、NSP2和NSP4上 (Dea et al. 2000; Snijder et al. 1998)。PRRTC 的形成依賴于這些非結(jié)構(gòu)蛋白的正確翻譯及組裝，組裝成功的 RTC 圍繞在內(nèi)質(zhì)近，進一步進行基因組的復(fù)制和病毒顆粒的組裝，包括亞基因組的合成及翻譯，產(chǎn)條編碼不同結(jié)構(gòu)蛋白的亞基因組，在亞基因組的序列兩端存在共同的非編碼區(qū) 5’和度分別為 190-220 nt 和 150 nt，其對亞基因組的翻譯過程至關(guān)重要，亞基因組進一成病毒顆粒組裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白 (de Vries et al. 1990; Kroese et al. 2008)。

圖 1-4 PRRSV 膜蛋白相互作用（引自 (Das et a1．，2010)）he PRRSV envelope protein complex of PRRSV (cited from (Das et a1顆粒的組裝，目前認為最主要的蛋白是 GP5、M 和 N 蛋白使病毒正確組裝。有研究報道 GP2a/3/4 和 E 蛋白是病毒感毒形成的重要蛋白，但是也會參與病毒組裝，這四個蛋白在，表達在病毒表面，缺一不可。另外這個多元復(fù)合物中糖蛋體 CD163 相互作用，對于病毒入侵至關(guān)重要 (Das et al. 20蛋白，GP5 和 M 蛋白作為外源物質(zhì)對于宿主免疫反應(yīng)有強亞單位疫苗的開發(fā) (Pirzadeh et al. 1998)。同時，研究發(fā)現(xiàn) 聯(lián)表達后，其對于宿主細胞的免疫刺激效應(yīng)顯著增強，GP白但是其可以與 GP5 協(xié)同作用從而增強機體的抗病毒免疫預(yù)防和控制臨床上引起嚴重的經(jīng)濟損失，因此自此病出現(xiàn)以來，關(guān)于止過，常規(guī)的疫苗類型分為將 PRRSV 滅活的滅活疫苗和將

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳漢平;“七七”天癸竭時女子自身免疫識別狀態(tài)的觀察[J];中國醫(yī)藥學(xué)報;1989年04期

2 吳玉章;;T細胞免疫識別研究進展[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2010年02期

3 曹顏霞;熊思東;徐薇;;固有免疫識別結(jié)核分枝桿菌及其效應(yīng)機制[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2012年04期

4 王楠;呂晶晶;;基于免疫理論的企業(yè)風(fēng)險識別能力研究[J];今日財富;2017年21期

5 周艷敏;曹佩霞;;母-胎免疫識別低下型反復(fù)流產(chǎn)的研究進展[J];江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年01期

6 田志剛;孫lm;;天然免疫識別與外周免疫耐受[J];中國腫瘤生物治療雜志;2006年05期

7 呂群燕;熊思東;高曉明;尹芝南;董爾丹;;國家自然科學(xué)基金重大項目“自身免疫識別與應(yīng)答的機制及調(diào)節(jié)研究”結(jié)題綜述[J];中國科學(xué)基金;2015年01期

8 胡燁;許小青;;固有免疫識別與調(diào)控分子機制的研究進展[J];中國腫瘤生物治療雜志;2013年04期

9 李雷;天然免疫識別的機制與途徑[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2002年05期

10 吳玉章;CTL的免疫識別和效應(yīng)機制[J];中國免疫學(xué)雜志;2001年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳建忠;;固有免疫識別研究進展[A];浙江省醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)病毒學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

2 曹雪濤;;免疫識別和免疫調(diào)節(jié)研究進展[A];中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

3 曹雪濤;;免疫識別與免疫調(diào)控分子機制研究[A];第八屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2012年

4 曹雪濤;;免疫識別、免疫調(diào)控與免疫治療的分子機制研究[A];生命的分子機器及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)——2012年全國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要集[C];2012年

5 董學(xué)會;Bradley Olsen;;基于抗體/納米抗體的三維免疫識別傳感器[A];中國化學(xué)會2017全國高分子學(xué)術(shù)論文報告會摘要集——主題C：高分子物理與軟物質(zhì)[C];2017年

6 魏麗霞;羅輝艷;;惡性腫瘤患者住院心理表現(xiàn)的分析及護理[A];中華護理學(xué)會全國腫瘤護理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2009年

7 田志剛;;天然免疫識別與腫瘤生物治療[A];第九屆全國腫瘤生物治療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

8 吳玉章;;抗原的免疫識別和抗原工程[A];中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

9 文代華;曹娜靜;張景海;張嶸;;昆蟲ALP蛋白的免疫識別作用研究[A];第九屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2014年

10 馬金柱;王北艷;崔玉東;;Nod樣受體的研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 朱國旺;治療RSA中西醫(yī)結(jié)合前景廣闊[N];中國醫(yī)藥報;2004年

2 記者 唐先武;我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)天然免疫識別與調(diào)控新機制[N];科技日報;2013年

3 記者 唐先武;我科學(xué)家專題評論免疫識別新途徑新機制[N];科技日報;2009年

4 記者 唐先武;我發(fā)現(xiàn)免疫識別與天然免疫功能調(diào)控新機制[N];科技日報;2011年

5 李燕燕 劉丙生;自主創(chuàng)新結(jié)碩果乘風(fēng)破浪書新篇[N];科技日報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 謝莎;豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原相關(guān)分子模式鑒定及其免疫識別機制研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

2 董超華;克氏原螯蝦兩種模式識別受體基因的克隆、重組表達及功能分析[D];中國海洋大學(xué);2009年

3 趙承梅;納米載體介導(dǎo)干預(yù)免疫識別的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

4 李亞斐;超抗原SED免疫識別機制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

5 王雷雷;扇貝補體相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)及功能研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2013年

6 楊嘉龍;櫛孔扇貝關(guān)鍵模式識別受體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答機制研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2011年

7 王楠;免疫視角下企業(yè)風(fēng)險管理要素與風(fēng)險管理績效關(guān)系研究[D];吉林大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 錢樹英;益氣補腎方治療母—胎免疫識別低下型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床療效觀察[D];浙江中醫(yī)藥大學(xué);2016年

2 石吟;益氣補腎方對母—胎免疫識別異常復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者孕早期免疫調(diào)節(jié)的影響[D];浙江中醫(yī)藥大學(xué);2017年

3 曾谷城;基于原子力顯微術(shù)的生物分子免疫識別[D];暨南大學(xué);2005年

4 張俊;玫瑰無須渻卵黃脂磷蛋白是具有調(diào)理素功能的免疫識別因子[D];中國海洋大學(xué);2010年

5 謝輝;基于原子力顯微術(shù)的免疫分子識別[D];暨南大學(xué);2006年

6 劉琳;櫛孔扇貝(Chlamys farreri)新型清道夫受體的基因克隆、重組表達及活性分析[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2010年

7 蔡軍偉;LPS對人CIAS1基因表達的影響及Cryopyrin結(jié)構(gòu)與功能分析[D];暨南大學(xué);2006年

8 艾軍華;hTLR9表達及其介導(dǎo)HPV11免疫識別分子機制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

本文編號：2832984