SR-B1作為高密度脂蛋白的生理性受體,參與高密度脂蛋白—膽固醇酯的選擇性吸收和類(lèi)固醇激素的生成。盡管SR-B1在肝臟、腎上腺和卵巢等的功能已有很多研究,但其在大鼠發(fā)情周期的卵巢和子宮的表達(dá)研究較少。本論文應(yīng)用IHC、real-time PCR和western blot等方法,在分析大鼠正常發(fā)情周期的卵巢和子宮SR-B1表達(dá)的基礎(chǔ)上,檢測(cè)了外源類(lèi)固醇激素處理對(duì)其表達(dá)的影響,為研究SR-B1在卵巢卵泡發(fā)育、黃體發(fā)育和子宮功能等方面發(fā)揮作用提供試驗(yàn)依據(jù)。此外,我們利用亞砷酸鈉構(gòu)建大鼠特異性卵巢氧化應(yīng)激模型,對(duì)SR-B1及類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵基因StAR、P450scc和3β-HSD的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),對(duì)進(jìn)一步了解SR-BI和StAR等基因參與機(jī)體內(nèi)類(lèi)固醇激素生成,解釋亞砷酸鈉干擾卵巢的正常生殖生理的機(jī)制具有一定的科學(xué)價(jià)值。主要內(nèi)容如下:1 SR-B1在大鼠發(fā)情周期卵巢和子宮中的定位與表達(dá)為了研究SR-B1在大鼠發(fā)情周期卵巢和子宮中的定位與表達(dá),通過(guò)陰道涂片法確定發(fā)情周期,real-time PCR結(jié)果顯示卵巢SR-B1 mRNA在大鼠發(fā)情前期至發(fā)情后期的表達(dá)水平持續(xù)升高,而在間情期的表達(dá)顯著降低(P0.05);且western blotting結(jié)果顯示其表達(dá)模式與mRNA的相似。子宮SR-B1的mRNA和蛋白的表達(dá)模式也一致:在發(fā)情前期表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)期(P0.05)。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)SR-B1蛋白主要定位于各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞和膜細(xì)胞質(zhì)中,在間質(zhì)和黃體中也存在表達(dá)。在發(fā)情周期任何階段的黃體上表達(dá)很強(qiáng),但不在顆粒細(xì)胞中表達(dá)。SR-B1主要定位在細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜中,而不是在細(xì)胞核上。在子宮中,SR-B1蛋白主要定位于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細(xì)胞質(zhì),在平滑肌細(xì)胞質(zhì)上也有強(qiáng)表達(dá),而在間質(zhì)細(xì)胞上幾乎無(wú)表達(dá)。由上述結(jié)果可知,SR-B1在大鼠發(fā)情周期卵巢和子宮上表達(dá),可能參與卵泡發(fā)育、黃體功能和子宮功能的調(diào)節(jié)。2外源性類(lèi)固醇激素對(duì)大鼠卵巢和子宮SR-B1表達(dá)的影響為了研究卵巢和子宮SR-B1在大鼠發(fā)情周期中的調(diào)控機(jī)制,利用17β-雌二醇(E_2)、孕酮(P_4)、或其抑制劑處理未性成熟大鼠,連續(xù)注射三天(從出生后第24天至26天)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)類(lèi)固醇激素可促進(jìn)大鼠卵巢和子宮的增重。Real-time PCR和western blotting結(jié)果均表明,經(jīng)過(guò)E2處理后,大鼠卵巢和子宮的SR-B1表達(dá)水平均顯著高于其它處理組(P0.05)。而P4單獨(dú)處理的效果不明顯(P0.05),E2和P4協(xié)同處理卻能夠顯著促進(jìn)卵巢和子宮SR-B1的表達(dá)(P0.05);采用雌激素受體拮抗劑(ICI 182780)預(yù)處理,顯著降低雌激素誘導(dǎo)的SR-B1的表達(dá)水平(P0.05),而孕激素受體拮抗劑(RU486)則對(duì)SR-B1表達(dá)沒(méi)有顯著影響(P0.05)。上述結(jié)果證實(shí),雌激素可顯著促進(jìn)SR-B1在早期大鼠卵巢和子宮的表達(dá),且雌激素受體參與了雌激素介導(dǎo)的SR-B1表達(dá)調(diào)控。3大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型構(gòu)建及類(lèi)固醇激素合成相關(guān)基因的表達(dá)機(jī)體內(nèi)SR-B1和StAR等基因在類(lèi)固醇激素的合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步檢測(cè)SR-B1和StAR等類(lèi)固醇激素合成相關(guān)基因在大鼠卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)情況,利用亞砷酸鈉構(gòu)建大鼠卵巢氧化應(yīng)激模型,并對(duì)其進(jìn)行評(píng)估和檢測(cè)。20只成年大鼠平均隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組,分別隔日腹腔注射生理鹽水和亞砷酸鈉溶液。通過(guò)HE檢測(cè)卵巢的組織形態(tài)學(xué),放射免疫測(cè)定血清性激素水平,生化比色法測(cè)定組織氧化標(biāo)記物來(lái)評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激模型。利用real-time PCR方法檢測(cè)卵巢SR-B1、StAR、P450scc和3β-HSD基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,處理組卵巢的組織結(jié)構(gòu)破壞,卵泡大量閉鎖;雌激素和孕激素水平顯著降低;氧化標(biāo)記物中的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量顯著升高,但谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著降低;定量PCR結(jié)果表明處理組的4個(gè)基因表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。本試驗(yàn)證實(shí)了這些類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵基因在大鼠卵巢氧化應(yīng)激時(shí)的表達(dá)受到干擾和破壞,這為解釋亞砷酸鈉干擾哺乳動(dòng)物卵巢的正常生殖生理機(jī)制提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：S814
【部分圖文】：

ｎ－ａｎａｌｏｇｏｕｓ－ｌ，（ＸＡ－ｌ）序列間具有８１％的同源性１＂１。逡逑作為一種細(xì)胞表面糖蛋白，ＳＲ－Ｂ１的相對(duì)分子質(zhì)量為８２Ｘ１０３，含有５０９個(gè)氨逡逑基酸殘基，在ＳＤＳ凝膠電泳上的分子量大小為８２？８５邋ｋＤａ邋（圖１－１）；其二級(jí)結(jié)構(gòu)逡逑包括兩個(gè)胞漿域、兩個(gè)跨膜域和一個(gè)胞外域。蛋白結(jié)構(gòu)形如馬蹄樣，其中環(huán)狀胞外逡逑域較長(zhǎng)，由４０３個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域有１０個(gè)Ｎ連接的糖基化位點(diǎn)，富含逡逑半腕氨酸，這對(duì)于ＨＤＬＣＥ的選擇性吸收至關(guān)重要；Ｎ末端和Ｃ末端位于胞質(zhì)內(nèi)，逡逑兩個(gè)胞漿域分別含有８?jìng)�(gè)（Ｎ末端）和４７個(gè)（Ｃ末端）氨基酸殘基；兩個(gè)跨膜域緊逡逑接著Ｎ末端和Ｃ末端，分別由２８?jìng)�(gè)和２３個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成ｌＡＭＩ。ＳＲ－ＢＩＩ是礎(chǔ)－公／逡逑ｍＲＮＡ選擇性剪切體，它們僅在胞內(nèi)域的Ｃ末端有所差異ＩＭＩ。逡逑ＳＲ－ＢＩ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑８２－８５邋ｋＤａ邐０邋－邋ｃｌａｍｐ／ｐｏｚｋｉ逡逑巧：邋心邐，－Ｌ？如，Ｚｉｐｐｅｒ逡逑５０９邋ａ．ａ．邐々邐聲邋Ｖ＊邐＠邋■邋ｐｔｓ－ｉ逡逑＾＾＜＾＾＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＂＊＊＊＾＾１＾、－／ｔｖ邋■邋Ｃｎｔｔｃａｉ邋ｒＭｔｄｕＭ逡逑／Ｎａ邐４０３邋ａ．ａ．逡逑ｆ邋＼逡逑ＣＸＸＸ＞0＜Ｚ＞00Ｃ：｜000000000000000000＾Ｃ－＞＜１＞？000＾0＊逡逑２８

轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行再循環(huán)或Ｗ膽酸形式排出體外的過(guò)程，這是機(jī)體清除多余膽固醇的逡逑重要生理途徑。若ＲＣＴ過(guò)程受影響，血漿中過(guò)量的脂質(zhì)將沉積在動(dòng)脈壁，最終導(dǎo)致逡逑多種也腦血管疾病。肝臟ＳＲ－Ｂ１參與機(jī)體內(nèi)ＲＣＴ邋—般分為Ｈ個(gè)步驟（如圖１－３）：逡逑第一步最為關(guān)鍵，即膽固醇從肝外組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)出：細(xì)胞膜上的ＡＴＰ結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋逡逑白邋Ａ１邋（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｐｒｏ化ｉｎＡｌ，ＡＢＣＡｌ）將細(xì)胞內(nèi)自由膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)逡逑出細(xì)胞外，與ａｐｏＡｌ結(jié)合生成盤(pán)狀前ｐ－ＨＤＵ第二步為膽固醇的醋化及膽固醇醋逡逑的轉(zhuǎn)運(yùn)：血漿中的卵a(bǔ)愔ü檀賈嶙潑福ǎ歟澹愕兀椋睿哄澹悖瑁錚歟澹螅簦澹潁錚戾澹幔悖戾澹簦潁幔睿螅媯澹潁幔螅澹義希蹋茫粒裕┙褁鎦鬧瑧溁頻降ü檀紏L基上，使膽固醇發(fā)生醋化；ＨＤＬＣＥ在膽逡逑固醇醋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ邋ｅｓｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＣＥＴＰ）的作用下，被轉(zhuǎn)運(yùn)至ＶＬＤＬ逡逑生成Ｌ化；第Ｈ步為ＨＤＬ被肝細(xì)胞吸收；肝細(xì)胞膜上皿Ｌ受體－ＳＲ－Ｂ１可選擇性逡逑吸收膽固醇醋，最終合成膽汁酸或直接通過(guò)膽汁排出體外，也可傳遞到類(lèi)固醇激素逡逑生成組織（腎上腺、卵巢和睪丸等）生成類(lèi)固醇激素。逡逑先前研究已經(jīng)證實(shí)

圖２－１大鼠�。樱坊虻臄U(kuò)增曲線和溶解曲線逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａ打ｄ邋ｍｅｌｔｉ打ｇ邋ｃｕｒｖｅｓ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋５／？－巧７邋ｇｅｎｅ逡逑

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