SR-B1作為高密度脂蛋白的生理性受體,參與高密度脂蛋白—膽固醇酯的選擇性吸收和類固醇激素的生成。盡管SR-B1在肝臟、腎上腺和卵巢等的功能已有很多研究,但其在大鼠發(fā)情周期的卵巢和子宮的表達研究較少。本論文應用IHC、real-time PCR和western blot等方法,在分析大鼠正常發(fā)情周期的卵巢和子宮SR-B1表達的基礎上,檢測了外源類固醇激素處理對其表達的影響,為研究SR-B1在卵巢卵泡發(fā)育、黃體發(fā)育和子宮功能等方面發(fā)揮作用提供試驗依據(jù)。此外,我們利用亞砷酸鈉構建大鼠特異性卵巢氧化應激模型,對SR-B1及類固醇激素合成關鍵基因StAR、P450scc和3β-HSD的表達進行檢測,對進一步了解SR-BI和StAR等基因參與機體內(nèi)類固醇激素生成,解釋亞砷酸鈉干擾卵巢的正常生殖生理的機制具有一定的科學價值。主要內(nèi)容如下:1 SR-B1在大鼠發(fā)情周期卵巢和子宮中的定位與表達為了研究SR-B1在大鼠發(fā)情周期卵巢和子宮中的定位與表達,通過陰道涂片法確定發(fā)情周期,real-time PCR結果顯示卵巢SR-B1 mRNA在大鼠發(fā)情前期至發(fā)情后期的表達水平持續(xù)升高,而在間情期的表達顯著降低(P0.05);且western blotting結果顯示其表達模式與mRNA的相似。子宮SR-B1的mRNA和蛋白的表達模式也一致:在發(fā)情前期表達水平顯著高于其他時期(P0.05)。免疫組化結果發(fā)現(xiàn)SR-B1蛋白主要定位于各級卵泡的卵母細胞和膜細胞質(zhì)中,在間質(zhì)和黃體中也存在表達。在發(fā)情周期任何階段的黃體上表達很強,但不在顆粒細胞中表達。SR-B1主要定位在細胞質(zhì)和質(zhì)膜中,而不是在細胞核上。在子宮中,SR-B1蛋白主要定位于子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮細胞質(zhì),在平滑肌細胞質(zhì)上也有強表達,而在間質(zhì)細胞上幾乎無表達。由上述結果可知,SR-B1在大鼠發(fā)情周期卵巢和子宮上表達,可能參與卵泡發(fā)育、黃體功能和子宮功能的調(diào)節(jié)。2外源性類固醇激素對大鼠卵巢和子宮SR-B1表達的影響為了研究卵巢和子宮SR-B1在大鼠發(fā)情周期中的調(diào)控機制,利用17β-雌二醇(E_2)、孕酮(P_4)、或其抑制劑處理未性成熟大鼠,連續(xù)注射三天(從出生后第24天至26天)。結果發(fā)現(xiàn)類固醇激素可促進大鼠卵巢和子宮的增重。Real-time PCR和western blotting結果均表明,經(jīng)過E2處理后,大鼠卵巢和子宮的SR-B1表達水平均顯著高于其它處理組(P0.05)。而P4單獨處理的效果不明顯(P0.05),E2和P4協(xié)同處理卻能夠顯著促進卵巢和子宮SR-B1的表達(P0.05);采用雌激素受體拮抗劑(ICI 182780)預處理,顯著降低雌激素誘導的SR-B1的表達水平(P0.05),而孕激素受體拮抗劑(RU486)則對SR-B1表達沒有顯著影響(P0.05)。上述結果證實,雌激素可顯著促進SR-B1在早期大鼠卵巢和子宮的表達,且雌激素受體參與了雌激素介導的SR-B1表達調(diào)控。3大鼠卵巢氧化應激模型構建及類固醇激素合成相關基因的表達機體內(nèi)SR-B1和StAR等基因在類固醇激素的合成過程中發(fā)揮重要作用。為了進一步檢測SR-B1和StAR等類固醇激素合成相關基因在大鼠卵巢氧化應激狀態(tài)下的表達情況,利用亞砷酸鈉構建大鼠卵巢氧化應激模型,并對其進行評估和檢測。20只成年大鼠平均隨機分為對照組和處理組,分別隔日腹腔注射生理鹽水和亞砷酸鈉溶液。通過HE檢測卵巢的組織形態(tài)學,放射免疫測定血清性激素水平,生化比色法測定組織氧化標記物來評價氧化應激模型。利用real-time PCR方法檢測卵巢SR-B1、StAR、P450scc和3β-HSD基因的表達水平。結果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,處理組卵巢的組織結構破壞,卵泡大量閉鎖;雌激素和孕激素水平顯著降低;氧化標記物中的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量顯著升高,但谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著降低;定量PCR結果表明處理組的4個基因表達水平顯著降低(P0.05)。本試驗證實了這些類固醇激素合成關鍵基因在大鼠卵巢氧化應激時的表達受到干擾和破壞,這為解釋亞砷酸鈉干擾哺乳動物卵巢的正常生殖生理機制提供理論依據(jù)。
【學位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S814
【部分圖文】：

ｎ－ａｎａｌｏｇｏｕｓ－ｌ，（ＸＡ－ｌ）序列間具有８１％的同源性１＂１。逡逑作為一種細胞表面糖蛋白，ＳＲ－Ｂ１的相對分子質(zhì)量為８２Ｘ１０３，含有５０９個氨逡逑基酸殘基，在ＳＤＳ凝膠電泳上的分子量大小為８２？８５邋ｋＤａ邋（圖１－１）；其二級結構逡逑包括兩個胞漿域、兩個跨膜域和一個胞外域。蛋白結構形如馬蹄樣，其中環(huán)狀胞外逡逑域較長，由４０３個氨基酸殘基構成，該結構域有１０個Ｎ連接的糖基化位點，富含逡逑半腕氨酸，這對于ＨＤＬＣＥ的選擇性吸收至關重要；Ｎ末端和Ｃ末端位于胞質(zhì)內(nèi)，逡逑兩個胞漿域分別含有８個（Ｎ末端）和４７個（Ｃ末端）氨基酸殘基；兩個跨膜域緊逡逑接著Ｎ末端和Ｃ末端，分別由２８個和２３個氨基酸殘基構成ｌＡＭＩ。ＳＲ－ＢＩＩ是礎－公／逡逑ｍＲＮＡ選擇性剪切體，它們僅在胞內(nèi)域的Ｃ末端有所差異ＩＭＩ。逡逑ＳＲ－ＢＩ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑８２－８５邋ｋＤａ邐０邋－邋ｃｌａｍｐ／ｐｏｚｋｉ逡逑巧：邋心邐，－Ｌ？如，Ｚｉｐｐｅｒ逡逑５０９邋ａ．ａ．邐々邐聲邋Ｖ＊邐＠邋■邋ｐｔｓ－ｉ逡逑＾＾＜＾＾＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＂＊＊＊＾＾１＾、－／ｔｖ邋■邋Ｃｎｔｔｃａｉ邋ｒＭｔｄｕＭ逡逑／Ｎａ邐４０３邋ａ．ａ．逡逑ｆ邋＼逡逑ＣＸＸＸ＞0＜Ｚ＞00Ｃ：｜000000000000000000＾Ｃ－＞＜１＞？000＾0＊逡逑２８

轉(zhuǎn)運到肝臟進行再循環(huán)或Ｗ膽酸形式排出體外的過程，這是機體清除多余膽固醇的逡逑重要生理途徑。若ＲＣＴ過程受影響，血漿中過量的脂質(zhì)將沉積在動脈壁，最終導致逡逑多種也腦血管疾病。肝臟ＳＲ－Ｂ１參與機體內(nèi)ＲＣＴ邋—般分為Ｈ個步驟（如圖１－３）：逡逑第一步最為關鍵，即膽固醇從肝外組織細胞中轉(zhuǎn)出：細胞膜上的ＡＴＰ結合盒轉(zhuǎn)運蛋逡逑白邋Ａ１邋（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｐｒｏ化ｉｎＡｌ，ＡＢＣＡｌ）將細胞內(nèi)自由膽固醇轉(zhuǎn)運逡逑出細胞外，與ａｐｏＡｌ結合生成盤狀前ｐ－ＨＤＵ第二步為膽固醇的醋化及膽固醇醋逡逑的轉(zhuǎn)運：血漿中的卵a愔ü檀賈嶙潑福ǎ歟澹愕兀椋睿哄澹悖瑁錚歟澹螅簦澹潁錚戾澹幔悖戾澹簦潁幔睿螅媯澹潁幔螅�，辶x希蹋茫粒裕┙褁鎦鬧瑧溁頻降ü檀紏L基上，使膽固醇發(fā)生醋化；ＨＤＬＣＥ在膽逡逑固醇醋轉(zhuǎn)運蛋白（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ邋ｅｓｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＣＥＴＰ）的作用下，被轉(zhuǎn)運至ＶＬＤＬ逡逑生成Ｌ化；第Ｈ步為ＨＤＬ被肝細胞吸收；肝細胞膜上皿Ｌ受體－ＳＲ－Ｂ１可選擇性逡逑吸收膽固醇醋，最終合成膽汁酸或直接通過膽汁排出體外，也可傳遞到類固醇激素逡逑生成組織（腎上腺、卵巢和睪丸等）生成類固醇激素。逡逑先前研究已經(jīng)證實

圖２－１大鼠邸－Ｓ７基因的擴增曲線和溶解曲線逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａ打ｄ邋ｍｅｌｔｉ打ｇ邋ｃｕｒｖｅｓ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋５／？－巧７邋ｇｅｎｅ逡逑

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號：2832863