十二指腸賈第鞭毛蟲(Giardia duodenalis)屬于全球范圍內(nèi)的寄生蟲。在亞洲、非洲、拉丁美洲每年大約2億人感染賈第蟲,并且表現(xiàn)出一定的臨床癥狀。因?yàn)榫哂腥诵蠊不夹?現(xiàn)已列入全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一。賈第蟲主要是通過排出具有感染性的包囊,使得其他宿主經(jīng)消化道引起感染,能引起腹瀉、頭暈、體重減輕。宿主范圍廣泛,感染人、猴子等靈長類,牛、羊、豬等家畜,鴿子、鸚鵡等鳥類,犬、貓等伴侶動物、狐貍、老虎等野生動物在內(nèi)的多種脊椎動物,此外,賈第蟲還可感染魚、兩棲動物、爬行動物、嚙齒動物。經(jīng)國內(nèi)外報道,隨著旅游業(yè)的發(fā)展,賈第蟲也成為了旅行者腹瀉的常見致病原。因此,作為重要的人畜共患病原體,賈第蟲在受到越來越高的關(guān)注。細(xì)胞骨架是真核生物特有的特征之一,賈第蟲作為最原始的真核生物,多種多樣的細(xì)胞骨架蛋白是令人震驚的,賈第素就屬于賈第蟲中含量豐富的骨架蛋白,與賈第蟲的吸附、入侵及感染有著密不可分的關(guān)系。同時,它也成為了人們研究真核生物的模型。賈第蟲分為攜病毒株和無病毒株滋養(yǎng)體,賈第蟲病毒是專性存在于賈第蟲體內(nèi)的一種雙鏈RNA病毒,賈第蟲病毒能感染無病毒株,雖然國內(nèi)外對于賈第蟲的流行病學(xué)調(diào)查研究很多,但是對賈第蟲病毒的研究卻不多,其感染過程及對無病毒株的影響都研究甚少,具體機(jī)理都不清楚。賈第蟲病毒具有感染性,感染5×10~5不會影響蟲體的正常狀態(tài)。因此,近年來,賈第蟲病毒作為載體的用途越來越廣泛。賈第蟲病毒及他的外轉(zhuǎn)錄體都具有感染性。衣殼蛋白是主要的表達(dá)蛋白。賈第蟲病毒感染無病毒株滋養(yǎng)體,引起蟲體蛋白質(zhì)的變化以及其他物質(zhì)的變化都還不清楚。α賈第素作為賈第蟲重要的骨架成分,在與賈第蟲病毒之間應(yīng)該會有某種關(guān)系。本研究根據(jù)GenBank中α-15-giardin序列設(shè)計引物,培養(yǎng)賈第蟲至滿瓶,進(jìn)行收集蟲體及提取了總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增α-15-giardin基因,成功構(gòu)建了大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-α-15,將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行pGEX-4T-α-15融合蛋白的原核表達(dá)。通過SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)分析其表達(dá)形式,利用切膠法獲得較純的融合蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行免疫小鼠,制備了多克隆抗體,對α-15-賈第素蛋白在賈第蟲中進(jìn)行定位,然后在攜病毒株與無病毒株滋養(yǎng)體進(jìn)行α-15-賈第素蛋白的熒光相對定量PCR檢測,以及將攜病毒株和無病毒株滋養(yǎng)體進(jìn)行總蛋白的提取,用制備的多抗作為一抗進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)。通過免疫小鼠,獲得了效價高達(dá)1:51200、特異性高的免疫血清。熒光定位試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其位于賈第蟲的細(xì)胞質(zhì),靠近細(xì)胞質(zhì)膜的部位多一些,腹吸盤的位置幾乎沒有分布。熒光相對定量PCR試驗(yàn)結(jié)果為α-15-賈第素蛋白在攜病毒株滋養(yǎng)體中mRNA表達(dá)量是無病毒株的滋養(yǎng)體表達(dá)量的8-10倍。Western Blot試驗(yàn)結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果一致,α-15-賈第素蛋白在攜病毒株滋養(yǎng)體中蛋白表達(dá)量高于無病毒株的滋養(yǎng)體表達(dá)量。此研究對于α-15-賈第素蛋白在賈第蟲體內(nèi)的作用及賈第蟲病毒與賈第素之間的關(guān)系、對賈第蟲新藥靶點(diǎn)的開發(fā)和賈第蟲的診斷預(yù)防具有重要意義。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.7
【部分圖文】：

A：犬賈第蟲攜病毒株總 RNA B：犬賈第蟲無病毒株總 RNAA: Total RNA of G.canis with virus; B: Total RNA of G.canis without virus圖 3-1 賈第蟲總 RNA 提取結(jié)果Fig. 3-1 Results of total RNA extraction of Giardia-giardin 基因擴(kuò)增結(jié)果iardin 基因 PCR 擴(kuò)增后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳（圖 3-2）可見約 912 bp與預(yù)期相符。M：DNA marker DL2000； 1：α-15-giardin 基因 PCR 產(chǎn)物

犬賈第蟲攜病毒株總 RNA B：犬賈第蟲無病毒株總 RNA of G.canis with virus; B: Total RNA of G.canis wit圖 3-1 賈第蟲總 RNA 提取結(jié)果Fig. 3-1 Results of total RNA extraction of Giardia 基因擴(kuò)增結(jié)果 PCR 擴(kuò)增后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳（圖 3-2）可見符。

M：預(yù)染蛋白 Marker；1：純化后的 pGEX-4T-α-15-giardin 融合蛋白Prestained protein Marker; 1: Purified pGEX-4T-α-15-giardin fusion pr圖 3-7 pGEX-4T-α-15-giardin 融合蛋白的純化Fig. 3-7 Purification of pGEX-4T-α-15-giardin fusion protei價的測定ISA 方法，倍比稀釋抗血清檢測制備的小鼠抗血清效價。 1：51200。說明 α-15-giardin 融合蛋白在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)驗(yàn)要求。異性分析合蛋白作為抗原，制備的多克隆抗體作為一抗進(jìn)行 Wes顯示，出現(xiàn)一條約為 59 kDa 的特異性條帶（見圖 3-8）59 kDa 的 α-15-giardin 融合蛋白。

【參考文獻(xiàn)】

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1 龐杏林;陳守義;高凱;麥惠霞;韓志剛;徐慧芳;楊智聰;;HIV/AIDS合并感染機(jī)會性致病原蟲血清流行病學(xué)分析[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2015年10期

2 武省;李國清;;藍(lán)氏賈第蟲致病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國動物傳染病學(xué)報;2015年01期

3 宋百軍;劉原源;宮鵬濤;李建華;楊舉;李赫;張西臣;;雙抗夾心ELISA檢測犬糞賈第蟲抗原方法的建立及應(yīng)用[J];中國病原生物學(xué)雜志;2014年10期

4 岑雙慶;李有全;李亞瓊;李安巖;何海寧;劉志杰;陳澤;楊吉飛;關(guān)貴全;牛慶麗;劉愛紅;任巧云;羅建勛;殷宏;;環(huán)形泰勒蟲微線體-棒狀體蛋白的亞細(xì)胞定位分析[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2014年08期

5 王洋;田喜鳳;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的免疫逃避機(jī)制[J];中國人獸共患病學(xué)報;2013年09期

6 王洋;王沂;楊文思;李冀;余源;沈海娥;劉青;田喜鳳;;藍(lán)氏賈第鞭毛蟲α-4賈第素特異性多克隆抗體的制備及免疫電鏡定位研究[J];中國病原生物學(xué)雜志;2012年12期

7 齊萌;張小三;張素梅;寧長申;張龍現(xiàn);;賈第蟲種類、基因型及其分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2009年06期

8 陳麗鳳;李建華;張西臣;劉全;趙月平;曹利利;;犬賈第蟲攜病毒株體外純培養(yǎng)的建立[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2006年04期

9 趙永軍,張西臣,劉全,李建華,尹繼剛,楊舉,吳濤;犬賈第蟲純培養(yǎng)的建立[J];中國人獸共患病雜志;2005年08期

10 劉全,張西臣;藍(lán)氏賈第蟲基因轉(zhuǎn)染研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病雜志;2004年03期

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1 李凌丹;犬賈第蟲不同蟲株及發(fā)育階段的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2012年

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1 張斯雯;賈第蟲賈第素蛋白多克隆抗體的制備及免疫熒光定位研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 黎巧;黑龍江哈爾濱地區(qū)部分鳥類、哺乳動物三種腸道原蟲分子流行病學(xué)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 趙春燕;茴香霉素抗賈第蟲的作用研究[D];吉林大學(xué);2017年

4 王澤;旋毛蟲谷氨酸脫羧酶TsGAD的表達(dá)和定位及不同pH對其影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 余新剛;藍(lán)氏賈第蟲賈第素α-13及延伸因子EF-1α的原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 武省;藍(lán)氏賈第蟲賈第素α-18和α-12基因的克隆、原核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

7 程波;細(xì)胞骨架蛋白間相互作用對細(xì)胞骨架動力學(xué)特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

8 羅培驍;鯉春病毒血癥病毒G蛋白單抗和多抗的制備及特性鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

9 李棕松;犬賈第蟲Nested PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2013年

10 蘇艷;東北地區(qū)部分兒童及奶牛中隱孢子蟲和賈第蟲感染的分子流行病學(xué)調(diào)查[D];吉林大學(xué);2011年

本文編號：2831842