DNA甲基化是真核生物基因組中主要的表觀遺傳修飾之一,其在許多生物過程(包括胚胎發(fā)育)中起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用�；蚪MDNA甲基化圖譜由DNA甲基化和DNA去甲基化這兩個雙向、可逆過程維持形成,其動態(tài)變化對于哺乳動物胚胎的早期發(fā)育至關(guān)重要。目前,已經(jīng)提出了DNA去甲基化的復(fù)制依賴性“被動”模型和復(fù)制無關(guān)的“主動”模型。DNA被動去甲基化是通過DNA復(fù)制介導(dǎo)的稀釋而發(fā)生的,而主動去甲基化則需要TET家族成員作為氧化酶來去除DNA胞嘧啶五號碳上的甲基基團(tuán)。在小鼠中,Tet1在PGC中高度表達(dá),對于種系特異性基因的去甲基化和維持印記是必需的。此外,Tet3大量存在于受精卵中,起到介導(dǎo)小鼠早期胚胎DNA主動去甲基化的作用。然而,牛胚胎中DNA去甲基化是否由TET蛋白催化發(fā)生,具體哪一個家族成員在牛早期胚胎發(fā)育的去甲基化過程中起主導(dǎo)作用,以及Tet基因和牛胚胎早期發(fā)育的相關(guān)性等內(nèi)容一無所知。本研究首先利用熒光定量的方法檢測了卵母細(xì)胞以及IVF植入前胚胎的Tet家族成員的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在牛植入前胚胎中只有Tet2和Tet3被檢測到。與Tet3的表達(dá)量相比,Tet2的表達(dá)量相當(dāng)?shù)?這表明在牛早期胚胎發(fā)生重編程的過程中,Tet3起到了主要的作用,而不是Tet1和Tet2。我們采取利用TET酶抑制劑(DMOG)來阻止TET3酶活性的策略,來研究TET3蛋白對牛早期胚胎發(fā)育的影響。1mM DMOG的處理明顯增加了牛不同發(fā)育階段胚胎的5mC水平。同時,衛(wèi)星DNA和多能性基因啟動子的DNA甲基化水平顯著增加。實(shí)時PCR分析結(jié)果表明Nanog的轉(zhuǎn)錄水平在DMOG處理組中顯著降低。此外,TET蛋白的抑制會影響囊胚形成,導(dǎo)致囊胚率下降(17.1±1.3%VS 24.1±0.6%),根據(jù)TUNEL染色的結(jié)果,囊胚階段內(nèi)細(xì)胞團(tuán)凋亡的百分比顯著增加。另外,凋亡相關(guān)基因Bax的表達(dá)水平上調(diào),而Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果支持了TET3蛋白通過影響DNA甲基化重編程、基因表達(dá)和細(xì)胞凋亡進(jìn)而在牛早期胚胎發(fā)育中起到重要作用。自從第一個克隆動物Dolly誕生以來,體細(xì)胞核移植(SCNT)在多種哺乳動物物種中取得了成功。牛作為一種重要的家畜在我國具有重要的經(jīng)濟(jì)價值,SCNT技術(shù)在牛上得到了長期的應(yīng)用,效率卻一直很低。SCNT低效率的主要原因之一是供體細(xì)胞核中DNA甲基化重編程的不完全,導(dǎo)致胚胎發(fā)育期間異常的基因表達(dá)。我們欲采取在牛胎兒成纖維細(xì)胞中過表達(dá)Tet3基因,然后利用這種穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系作為供體細(xì)胞進(jìn)行牛的體細(xì)胞核移植的策略,來提高對供體細(xì)胞的DNA甲基化重編程,以此來提高牛SCNT效率。本試驗(yàn)最終構(gòu)建了pHBLV-CMV-Tet3-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro過表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)染到牛的胎兒成纖維細(xì)胞系中,為進(jìn)一步檢測Tet3基因在過表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)情況,針對與TET3重組成融合蛋白的Flag標(biāo)簽蛋白,我們分別做了免疫熒光和Western檢測,結(jié)果顯示在過表達(dá)Tet3的牛成纖維細(xì)胞系中檢測到了Flag標(biāo)簽蛋白的陽性信號,而在空白組與陰性對照組中,卻沒有檢測到。這表明我們不僅利用慢病毒載體成功將Tet3基因轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞中,還使其高效的表達(dá)出目的蛋白,這也為下一步提高牛SCNT效率奠定了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

圖 1.經(jīng)典位點(diǎn)特異性 DNA 維持甲基化模型的示意圖持 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性被抑制時，導(dǎo)致在一輪復(fù)制后產(chǎn)生NA，相當(dāng)于每個復(fù)制周期喪失 50％的甲基化，從而發(fā)生 D。相反，DNA 的主動去甲基化并不依賴于 DNA 復(fù)制而發(fā)生性直接從甲基化堿基去除甲基，或者通過非甲基化堿基來交乳動物中的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶乳動物中存在 Dnmt1，Dnmt3a 和 Dnmt3b 三種活性的 DNA缺乏催化活性的相關(guān)蛋白，稱為 Dnmt3L。哺乳動物 DNA 甲部分組成：具有可變大小的具有調(diào)控功能的多結(jié)構(gòu)域 N 端部

11圖2. 小鼠TET家族蛋白結(jié)構(gòu)示意圖2.2.2 TET 酶的底物選擇性TET酶的底物優(yōu)先性可以在三個不同的水平上觀察。首先，在CpG環(huán)境中主要檢測到5mC，但在非CpG環(huán)境中也觀察到5mC ，并且TET可能優(yōu)先于另一個環(huán)境。體外分析表明，人類TET2對5mCpC和5mCpA的活性低于對5mCpG的活性，可能是受到堿基堆積作用的阻礙[57]。因此，TET在CpG上下游環(huán)境中可能優(yōu)先選擇5mC。其次，5mC

半定量 PCR 檢測卵母細(xì)胞 MII 時期 TET 基因家族的相對 The expression of TET protein transcripts in bovine oocytedetected by Semi-quantitative PCRF 植入前胚胎 TET 基因家族的相對表達(dá)量CR 的結(jié)果表明， Tet3 在牛早期 IVF 胚胎中具有較高的 m囊胚階段表達(dá)量相對較低。Tet1 和 Tet2 在牛 MII 期卵母始終處于低表達(dá)水平(圖 1.2)。

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本文編號：2831586