青藏高原海拔高,大部分地區(qū)年平均氣溫低于0℃,屬于高寒地區(qū)。當?shù)刈匀坏蜏厍噘A存在發(fā)酵不充分和易于腐敗的難題,而針對低溫青貯發(fā)酵機理的研究報道卻較為少見。為了提高青藏高原當?shù)氐那噘A飼料品質(zhì),建立適合高寒地區(qū)的低溫青貯技術(shù)體系,本文主要進行了以下五部分研究:(1)為了篩選適合低溫青貯發(fā)酵的優(yōu)良起時乳酸菌,從青海的大部分地區(qū)和西藏的拉薩等典型地區(qū)采集80個冰草樣品,從中分離出112株乳酸菌代表株,通過16S rRNA基因序列分析,結(jié)合形態(tài)學特征和生理生化特性,將其鑒定到種或亞種水平。青藏高原本土冰草中附生乳酸菌資源十分豐富,其中39.13%為腸膜明串珠菌屬,21.74%為乳球菌屬,17.39%為腸球菌屬,其余少量為魏斯氏菌屬、肉食桿菌屬和片球菌屬等。對乳酸菌代表株進行了耐鹽、耐酸堿、耐高低溫脅迫生長實驗,以及抑菌活性檢測,篩選出廣譜抑菌活性的乳酸菌三株。其中QZ311(Pediococcus cellicola)和QZ1137(Leuconostoc mesenteroides)兩株代表株在3.0%和6.5%鹽濃度中能夠存活,在試驗條件5°C和10°C低溫、45°C和50°C高溫環(huán)境中生長良好,在pH 3.5-p H 9酸堿環(huán)境中能夠生長,并能產(chǎn)生廣譜抑菌素,對藤黃微球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用。(2)考慮到青藏高原環(huán)境惡劣和交通不便等問題,本研究分別采取乳熟期、蠟熟期、全熟期、全熟期收割后暴露3天和暴露10天的玉米秸稈樣品進行青貯預實驗,探究不同收獲期的秸稈青貯中的微生物概況、發(fā)酵品質(zhì)和體外瘤胃消化水平,以期為青藏高原實地取材提供參考。原材料中分離出13株乳酸菌代表株,經(jīng)鑒定歸為5個簇:檸檬明串珠菌(23.1%),類腸膜魏斯氏菌(15.4%),格氏乳球菌(23.1%),糞腸球菌(7.7%)和類植物乳桿菌(30.8%)。原材料收獲期為乳熟期、蠟熟期、全熟期、全熟期收割后暴露3天和10天所制作的青貯飼料中乳酸菌含量分別約為8、6、10、3.5和10 log CFU/g,不同成熟期的青貯飼料中優(yōu)勢乳酸菌也不同,其中格氏乳球菌和類植物乳桿菌最為常見。源自不同成熟期材料的青貯飼料中,均檢出大腸桿菌、好氧細菌、霉菌和酵母菌等病原菌。對青貯飼料的pH、氨態(tài)氮和化學成分進行測定分析,其不同成熟期的青貯飼料中蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量、干重、酸性洗滌纖維和有機質(zhì)含量有極顯著差別(P0.001),而體外瘤胃發(fā)酵24 h后干物質(zhì)的消化率在P=0.05水平?jīng)]有顯著差別。其中全熟期乳酸菌含量較高,酵母菌和霉菌含量相對較少,干物質(zhì)和水分含量適中,相對適合作為青貯材料。(3)在青貯早期階段,乳酸菌可作為添加劑以增加發(fā)酵的活性并促進發(fā)酵的進行。本研究設想,常溫發(fā)酵條件與低溫發(fā)酵條件相比,乳酸菌的最適接種劑量可能有所不同。為優(yōu)化青藏高原實地青貯的接種劑量,本研究在實驗室規(guī)模,探索了常溫(15-38°C)和低溫(4°C)條件下,不同接種劑量(0,6.52,7.52和8.52 log CFU/g FM)對燕麥(Avena sativa L.cv.Qinghai)和小麥(Triticum aestivum L.cv.Qinghai)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響。結(jié)果表明,在室溫條件下,增加乳酸菌的接種劑量很少或者不能提高青貯品質(zhì);低溫發(fā)酵條件下,增加乳酸菌的接種劑量可以顯著提高青貯品質(zhì)(P0.05),乳酸菌的接種劑量更大時,pH和氨態(tài)氮含量更低,乳酸菌的數(shù)量和乳酸含量增加,大腸桿菌被有效抑制。在本研究中,收獲的新鮮燕麥作物水分含量高達86.55%,不經(jīng)過萎蔫處理不能用于室溫青貯,但可以用作低溫青貯材料。分離自青藏高原小麥根部的植物乳桿菌QZ227(Lactobacillus plantaru)與商業(yè)菌株FG1相比,在室溫發(fā)酵條件對酵母菌有更好的抑制作用,在低溫發(fā)酵條件對大腸桿菌有更優(yōu)的抑制作用。本研究是第一次探索接種劑量對低溫青貯品質(zhì)的影響,為低溫青貯技術(shù)提供了依據(jù)。(4)本研究將分離自青藏高原的六株耐低溫、耐酸且產(chǎn)酸能力好的乳酸菌代表株應用于恒低溫燕麥青貯,分析其營養(yǎng)成分變化趨勢,以及乳酸菌和主要病原菌的動態(tài)變化規(guī)律,為高寒地區(qū)的自然低溫青貯提供參考。六株代表株分別為:酒窖片球菌QZ311(Pediococcus cellicola)和腸膜串珠菌QZ1137(Leuconostoc mesenteroides),植物乳桿菌QZ227(Lactobacillus plantarum),乳酸乳球菌QZ613(Lactococcus lactis),蒙氏腸球菌QZ251(Enterococcus mundtii)和乳酸乳球菌乳酸亞種QZ666(Lactococcus lactis subsp.lactis)。參照青貯成熟期和低溫劑量選擇的研究結(jié)果,將QZ227、QZ251、QZ613和QZ666作為單一添加劑,QZ311和QZ1137作為混合添加劑,以10 log CFU/g FM的接種濃度添加到全熟期燕麥中。在5℃恒低溫條件下,QZ227和QZ666處理組在青貯7天時pH已經(jīng)達到了3.94和3.79的理想水平,在青貯30天時,添加QZ251和QZ613的兩組燕麥青貯pH降到3.81和4.12的優(yōu)良水平,QZ311和QZ1137處理組也降到了4.26。在青貯7天至30天,乳酸菌處理組的大腸桿菌、芽孢桿菌、梭菌、酵母菌和霉菌等常見病原菌得到有效抑制。乳酸菌添加劑對恒低溫青貯燕麥的粗蛋白、粗脂肪等營養(yǎng)成分沒有顯著影響。恒低溫青貯條件下,五組乳酸菌添加劑均可快速降低全熟期燕麥pH并有效抑制青貯病原菌,有作為自然低溫青貯發(fā)酵起始劑的潛質(zhì)。(5)為建立適宜的自然低溫青貯體系,利用以上研究所篩選出的適合低溫青貯的優(yōu)良乳酸菌、選擇所確定的最適收獲期和低溫接種劑量,將分離自極端高寒環(huán)境中的五株廣譜抑菌特性的乳酸菌代表株用于當?shù)氐难帑満捅萸噘A發(fā)酵制作。五株乳酸菌代表株分別為植物乳桿菌QZ227,蒙氏腸球菌QZ251,酒窖片球菌QZ311,腸膜明串珠菌QZ1137和乳酸乳球菌QZ613,并以購買的商業(yè)菌株植物乳桿菌FG1(Lactobacillus plantarum)作陽性對照,以無菌水作為陰性對照。青貯發(fā)酵期間,自然環(huán)境的最高溫和最低溫分別為-22°C和23°C。接種了QZ227和FG1的冰草青貯30天時pH達到了4.15以下的理想水平。冰草青貯30天時對照組和乳酸菌處理組中均有不同數(shù)量的病原菌檢出,其中QZ227處理組中病原菌含量最少;青貯60天時,只有QZ311和QZ1137處理組中沒有檢出大腸桿菌,表明自然低溫青貯條件,QZ311和QZ1137對大腸桿菌有較好的抑制作用。本研究中所用的添加菌劑均可有效提高燕麥青貯的發(fā)酵品質(zhì),使其乳酸含量增高,pH降低到理想水平(≤4.17),并能明顯抑制青貯中的大腸桿菌、酵母菌和霉菌等病原菌。在整個發(fā)酵過程中,QZ227呈現(xiàn)出與商業(yè)菌株相當?shù)陌l(fā)酵能力,且在青貯儲藏7個月后,其所發(fā)酵的青貯飼料腐敗率顯著低于FG1。腐敗青貯飼料中的大腸桿菌,霉菌,梭菌和酵母菌等腐敗微生物進行了數(shù)量統(tǒng)計并分離保存,進一步測定分析表明,大腸桿菌是主要的產(chǎn)氨態(tài)氮病原菌,霉菌和酵母菌的產(chǎn)氨態(tài)氮能力則十分有限。本研究以分離自青藏高原的耐低溫、耐酸和具有廣譜抑菌特性的優(yōu)良乳酸菌為起時發(fā)酵劑,在常溫、自然低溫和恒低溫條件下分析不同青貯材料和不同起時發(fā)酵劑的青貯發(fā)酵動態(tài)變化,以不同成熟期的玉米秸稈青貯動態(tài)變化為參考,以低溫條件增加乳酸菌的接種劑量顯著提高青貯品質(zhì)為基礎,使青貯接種劑量提高到10 log CFU/g FM,將分離自高寒地區(qū)的優(yōu)良乳酸菌用于當?shù)氐娜炱谘帑満捅莸那噘A發(fā)酵制作之中,初步建立了適宜的自然低溫青貯體系。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S816.53
【部分圖文】：

不僅降低干物質(zhì)采食量和飼料轉(zhuǎn)化率，還會造成牲畜的瘤胃功能損傷，導致腹瀉、乳房炎等病癥發(fā)生，進而使產(chǎn)奶量降低。2.2 添加劑青貯青貯添加劑始于 60 年代，至今為止，65%以上的青貯飼料會使用添加劑。主要目的是引導發(fā)酵過程中乳酸為主的發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。添加劑青貯與自然青貯相比，青貯飼料的有機干重、粗蛋白、天然脂質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等化學成分沒有顯著差別，青貯完成之后的最終乳酸菌數(shù)量差別也不大11, 12。研究表明，干物質(zhì)含量低的青貯原料，可不經(jīng)萎蔫處理，青貯前混入乳酸菌發(fā)酵液添加劑即可有效提高青貯品質(zhì)13。青貯添加劑顯著影響青貯質(zhì)量，優(yōu)質(zhì)的青貯添加劑能夠顯著提高青貯飼料的品質(zhì)。研究表明，活的乳酸菌培養(yǎng)液可以減少急性瘤胃酸的發(fā)病率14，以添加有 12×107CFU/kg DM 的大麥谷物和大麥飼料飼喂牲畜，可以改善瘤胃發(fā)酵15，可能由于乳酸菌飼喂添加劑有助于產(chǎn)生適應乳酸環(huán)境的瘤胃菌群。

第二章 青藏高原地區(qū)冰草中乳酸菌的分離鑒定及抑菌效應分析20 g 切段樣品放置于 180 ml 的無菌水中，充分震蕩混勻，取液體依次稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5五個梯度，分別從 10-1，10-3，10-5稀釋液中吸取 μ/，用涂布棒均勻涂布在 MRS （Lactobacillus agar as described by De Man, Rogosaand Sharpe; Merck, Darmstadt, Germany）固體培養(yǎng)基上，厭氧培養(yǎng)箱中恒溫 30℃倒置培養(yǎng) 48 h。對 MRS 培養(yǎng)基上的單菌落統(tǒng)計計數(shù)，綜合菌落的表征信息如形態(tài)、顏色、透明度和大小等對單菌落進行辨別并編號，挑取不同編號的單菌落分別擴大培養(yǎng)，純化培養(yǎng)兩次，用面簽將擴大培養(yǎng)的代表株轉(zhuǎn)存于含有 10％二甲基亞砜的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB，QingDao Hopebio-Technology Co.,Ltd.Qingdao, China），-80℃超低溫冰箱存放備用。

第三章 不同成熟期玉米秸稈青貯的微生物概況、發(fā)酵品質(zhì)和體外瘤胃消化水平的研究三章 不同成熟期玉米秸稈青貯的微生物概況、發(fā)酵品和體外瘤胃消化水平的研究介青藏高原被稱為“世界屋脊”，是世界上除兩極以外最冷的地區(qū)91。寧至西藏拉薩的青藏鐵路全長 1956 公里（圖 3.1），于 2006 年 7 月，在此之前，青藏高原沒有其他更經(jīng)濟快速的交通方式92。青藏高原偏高、天氣條件惡劣等極端條件的限制，使得對該地區(qū)的任何研究都很。為了確定高寒地區(qū)自然青貯所需原材料的適宜取材時間，本研究預同收獲期的青貯材料進行先行評估，為青藏高原實地取材提供參考依

【參考文獻】

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本文編號：2831390