豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)導致的一種高度接觸性傳染疾病,其主要典型特征為母豬繁殖障礙及仔豬呼吸困難,臨床上造成大規(guī)模流產、死胎及仔豬死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。在當前養(yǎng)豬生產實踐中,免疫預防是豬場防控PRRS以降低生產損失的主要策略。但豬的PRRSV免疫效率不一,抗體保護作用有限,主要原因是目前關于豬PRRSV免疫應答不穩(wěn)定的分子機制尚不清楚。本研究采用全基因組轉錄組測序(RNA-seq)和甲基化測序(MeDIP-seq)的策略,探究連續(xù)兩代豬PRRSV免疫后不同抗體應答水平個體外周血單核細胞(PBMCs)中的基因表達、DNA甲基化狀態(tài)變化以及DNA甲基化對免疫相關基因表達的調控機制,以期從表觀遺傳學角度揭示差異免疫應答的調控機理,為豬PRRS的預防免疫及抗病育種提供新的依據(jù)。試驗1:通過RNA-seq鑒定妊娠母豬PRRSV不同抗體應答水平相關候選基因。本試驗以4頭具有高抗體應答水平、4頭中抗體應答水平和4頭低抗體應答水平長白妊娠母豬PBMCs為試驗材料。通過RNA-seq分析,共得到401個差異表達基因(q0.05)。其中上調差異表達基因91個,下調差異表達基因310個。差異表達基因GO分析和通路分析結果顯示差異表達基因富集在炎癥反應、創(chuàng)傷反應、細胞因子生成調控、防御應答、細胞程序性凋亡調控、細胞增殖、白細胞趨化和遷移及免疫系統(tǒng)進程等生物學過程。整合差異表達基因和QTL數(shù)據(jù)分析,得到11個抗體應答候選基因,包括MEGF9,NDRG1,SLA-8,C2,STX11,C-JUN,FOS,NFKBIA,TNF-α,IL-1α,IL-1β。試驗2:通過RNA-seq鑒定仔豬PRRSV不同抗體應答水平相關候選基因。為進一步探索母豬抗體應答水平差異與其仔豬免疫應答的關聯(lián),在母豬高抗組所產的仔豬中選擇出高抗體水平的仔豬,母豬低抗組所產的仔豬中選擇出低抗體水平的仔豬,本試驗以3頭具有高抗體應答水平和3頭低抗體應答水平仔豬PBMCs為試驗材料。通過RNA-seq分析,獲得86個差異表達基因(q0.05)。整合差異表達基因、前期母豬免疫應答研究結果和前人已報道的豬PRRSV免疫應答轉錄組數(shù)據(jù)比較分析,獲得6個仔豬抗體應答候選基因C-JUN,FOS,CCL4,TNF-α,NFKBIA,IL7R。通過MeDIP-seq技術構建不同抗體應答水平仔豬PBMCs全基因組甲基化圖譜,結果表明,高抗組仔豬在CpG密度為10-15個CpGs/kb區(qū)域具有更高的甲基化水平,低抗組仔豬CpG密度為15-20個CpGs/kb區(qū)域具有更高的甲基化水平;低抗組仔豬CpG島甲基化水平高于高抗組。通過啟動子區(qū)差異甲基化基因與差異表達基因重疊分析,顯示6個基因(PYY,CCR7,IL7R,CD59,RHOB,VASH1)的啟動子甲基化水平與基因表達量呈負相關。試驗3:連續(xù)兩代豬PRRSV不同抗體應答水平個體轉錄組同質性分析。本試驗以試驗1和試驗2為材料,通過對母豬與其仔豬PBMCs轉錄組進行同質性分析,發(fā)現(xiàn)在兩代豬中TNF-α,CCL 和NFKBIA基因的表達量與PRRSV抗體水平呈負相關,并用RT-qPCR技術進行母豬活體驗證了此結果。本研究對兩代豬PRRSV不同抗體應答水平PBMCs轉錄組和全基因組DNA甲基化分析,對PRRSV抗體免疫應答方面表觀遺傳學調控研究及組織特異性的甲基化水平分析研究提供了參考數(shù)據(jù)。
【學位單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

比如ＲＴ－ＰＣＲ、原位ＰＣＲ、巢式ＰＣＲ及核酸探針技術可以直接鑒定病料組織中的ＰＲＲＳＶ。逡逑１．１．２．４豬繁殖與呼吸綜合征的防治逡逑目前，ＰＲＲＳ在世界呈廣泛流行的趨勢（圖１－２），如何有效的防治ＰＲＲＳ，已成為世界逡逑養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。有關各國都在積極探索新的策略以控制ＰＲＲＳ，但成效并不顯著，給逡逑ＰＲＲＳ的防治工作造成困難的因素主要為免疫抑制、持續(xù)感染、亞臨床感染及容易繼發(fā)a|染逡逑等。因為沒有特效藥物能治療ＰＲＲＳ，預防免疫仍是防控ＰＲＲＳ的有效措施，并對此寄予厚逡逑望�，F(xiàn)在預防本病的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒活疫苗。使用滅活疫苗免疫時，因誘導產生逡逑的免疫反應持續(xù)時期短，常需進行多次免疫。與滅活疫苗相比之下，弱毒疫苗誘導的免疫反逡逑應持續(xù)時間更長，并且效果更好。但是，ＰＲＲＳＶ所產生的免疫應答反應，在引發(fā)自身免疫逡逑力和抵抗力、保護機體避免受到感染的同時，也可能造成病理過程、激化繼發(fā)感染，因此，逡逑有人形象地稱之為“雙刃劍”邋２４。逡逑３逡逑

色體的失活、基因印記、基因表達調控、胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展均發(fā)揮著至關重要的作逡逑用。在甲基轉移酶的催化作用下，基因組ＤＮＡ甲基模式得以建立與維持，并由甲基化ＣｐＧ逡逑結合蛋白識別甲基化信息。如圖１－４所示，哺乳動物中常見ＤＮＡ甲基轉移酶主要分為Ｄｒｎｎｔｌ、逡逑Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ，其中Ｄｎｍｔｌ的功能主要是維持ＤＮＡ甲基化狀態(tài)，艮Ｐ以母本鏈甲基化信逡逑息為模板，建立ＤＮＡ半保留復制所產生的子代新鏈的甲基化模式５５；邋Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ的逡逑功能主要是使ＤＮＡ重新甲基化，即催化非甲基化的ＤＮＡ序列到從頭甲基化（ｄｅｎｏ逡逑ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）的發(fā)生５６。這些甲基化轉移酶在胚胎和嬰兒發(fā)育過程中是不可或缺的酶類，其逡逑中Ｄｎｍｔ３ａ基因還會對造血干細胞的分化造成影響，并且該基因敲除的小鼠在出生幾周后無逡逑法存活５７，５８。這些結果說明了邋ＤＮＡ甲基化在脊椎動物分化發(fā)育過程中有著關鍵作用。逡逑８逡逑

圖１－５哺乳動物典型的ＤＮＡ甲基化模式（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ邋＆邋Ｂｉｒｄ２００９）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｔｙｐｉｃａｌ邋ＤＮＡ邋ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ邋ｌａｎｄｓｃａｐｅ邋ｉｎ邋ｍａｍｍａｌｓ邋（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ邋＆邋Ｂｉｒｄ邋２００９）逡逑基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化后，影響基因轉錄的機制主要有四種（圖１－６）：邋ａ）甲基基團逡逑深入到ＤＮＡ雙螺旋大溝內所造成的空間位阻能夠阻礙轉錄因子與識別序列的結合；ｂ）邋ＣｐＧ逡逑甲基化結合蛋白（ＭｅＣＰｌ、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２等）結合到甲基化ＣｐＧ位點，可以募逡逑集共抑制復合物到甲基化位點上，改變染色質構象，從而抑制基因轉錄；ｃ）ＤＮＭＴ酶與組逡逑蛋白去乙�；富蚪M蛋白甲基化轉移酶結合形成較為緊密的染色質構象而直接抑制轉錄；ｄ）逡逑甲基化ＣｐＧ結合蛋白結合在基因本體甲基化位點上，直接或通過影響相鄰染色質構象而阻逡逑礙轉錄的延伸６８。逡逑（ａ）邐（ｂ）逡逑（ｃ）邐Ａｃ邐（ｄ）逡逑［＼邋0ＮＭＴ邋Ｊｆ邋ｒ＾Ｈ３－Ｍｅ邐ｆ—？邐ＣＨ３逡逑＾ＣＨ３邐ｍｓ逡逑圖１－６邋ＤＮＡ甲基化抑制基因轉錄的分子機制（Ｋｌｏｓｅ＆邋Ｂｉｒｄ邋２００６）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－６邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（Ｋｌｏｓｅ邋＆邋Ｂｉｒｄ邋２００６）逡逑１．２．２．３基因本體白勺ＤＮＡ甲基化逡逑大多數(shù)基因本體（ｇｅｎｅ邋ｂｏｄｙ）缺乏ＣｐＧ島，但其甲基化的現(xiàn)象卻廣泛存在�；虮倔w逡逑甲基化對基因轉錄的影響目前還沒有明確的結論�；虮倔w內，夕卜顯子的甲基化程度比內含逡逑子較高

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Andrea K. PERRY;The host type I interferon response to viral and bacterial infections[J];Cell Research;2005年06期

本文編號：2831108