豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)導(dǎo)致的一種高度接觸性傳染疾病,其主要典型特征為母豬繁殖障礙及仔豬呼吸困難,臨床上造成大規(guī)模流產(chǎn)、死胎及仔豬死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在當(dāng)前養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中,免疫預(yù)防是豬場(chǎng)防控PRRS以降低生產(chǎn)損失的主要策略。但豬的PRRSV免疫效率不一,抗體保護(hù)作用有限,主要原因是目前關(guān)于豬PRRSV免疫應(yīng)答不穩(wěn)定的分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用全基因組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)和甲基化測(cè)序(MeDIP-seq)的策略,探究連續(xù)兩代豬PRRSV免疫后不同抗體應(yīng)答水平個(gè)體外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中的基因表達(dá)、DNA甲基化狀態(tài)變化以及DNA甲基化對(duì)免疫相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,以期從表觀遺傳學(xué)角度揭示差異免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)理,為豬PRRS的預(yù)防免疫及抗病育種提供新的依據(jù)。試驗(yàn)1:通過RNA-seq鑒定妊娠母豬PRRSV不同抗體應(yīng)答水平相關(guān)候選基因。本試驗(yàn)以4頭具有高抗體應(yīng)答水平、4頭中抗體應(yīng)答水平和4頭低抗體應(yīng)答水平長白妊娠母豬PBMCs為試驗(yàn)材料。通過RNA-seq分析,共得到401個(gè)差異表達(dá)基因(q0.05)。其中上調(diào)差異表達(dá)基因91個(gè),下調(diào)差異表達(dá)基因310個(gè)。差異表達(dá)基因GO分析和通路分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因富集在炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷反應(yīng)、細(xì)胞因子生成調(diào)控、防御應(yīng)答、細(xì)胞程序性凋亡調(diào)控、細(xì)胞增殖、白細(xì)胞趨化和遷移及免疫系統(tǒng)進(jìn)程等生物學(xué)過程。整合差異表達(dá)基因和QTL數(shù)據(jù)分析,得到11個(gè)抗體應(yīng)答候選基因,包括MEGF9,NDRG1,SLA-8,C2,STX11,C-JUN,FOS,NFKBIA,TNF-α,IL-1α,IL-1β。試驗(yàn)2:通過RNA-seq鑒定仔豬PRRSV不同抗體應(yīng)答水平相關(guān)候選基因。為進(jìn)一步探索母豬抗體應(yīng)答水平差異與其仔豬免疫應(yīng)答的關(guān)聯(lián),在母豬高抗組所產(chǎn)的仔豬中選擇出高抗體水平的仔豬,母豬低抗組所產(chǎn)的仔豬中選擇出低抗體水平的仔豬,本試驗(yàn)以3頭具有高抗體應(yīng)答水平和3頭低抗體應(yīng)答水平仔豬PBMCs為試驗(yàn)材料。通過RNA-seq分析,獲得86個(gè)差異表達(dá)基因(q0.05)。整合差異表達(dá)基因、前期母豬免疫應(yīng)答研究結(jié)果和前人已報(bào)道的豬PRRSV免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較分析,獲得6個(gè)仔豬抗體應(yīng)答候選基因C-JUN,FOS,CCL4,TNF-α,NFKBIA,IL7R。通過MeDIP-seq技術(shù)構(gòu)建不同抗體應(yīng)答水平仔豬PBMCs全基因組甲基化圖譜,結(jié)果表明,高抗組仔豬在CpG密度為10-15個(gè)CpGs/kb區(qū)域具有更高的甲基化水平,低抗組仔豬CpG密度為15-20個(gè)CpGs/kb區(qū)域具有更高的甲基化水平;低抗組仔豬CpG島甲基化水平高于高抗組。通過啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化基因與差異表達(dá)基因重疊分析,顯示6個(gè)基因(PYY,CCR7,IL7R,CD59,RHOB,VASH1)的啟動(dòng)子甲基化水平與基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。試驗(yàn)3:連續(xù)兩代豬PRRSV不同抗體應(yīng)答水平個(gè)體轉(zhuǎn)錄組同質(zhì)性分析。本試驗(yàn)以試驗(yàn)1和試驗(yàn)2為材料,通過對(duì)母豬與其仔豬PBMCs轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行同質(zhì)性分析,發(fā)現(xiàn)在兩代豬中TNF-α,CCL 和NFKBIA基因的表達(dá)量與PRRSV抗體水平呈負(fù)相關(guān),并用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行母豬活體驗(yàn)證了此結(jié)果。本研究對(duì)兩代豬PRRSV不同抗體應(yīng)答水平PBMCs轉(zhuǎn)錄組和全基因組DNA甲基化分析,對(duì)PRRSV抗體免疫應(yīng)答方面表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究及組織特異性的甲基化水平分析研究提供了參考數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

比如ＲＴ－ＰＣＲ、原位ＰＣＲ、巢式ＰＣＲ及核酸探針技術(shù)可以直接鑒定病料組織中的ＰＲＲＳＶ。逡逑１．１．２．４豬繁殖與呼吸綜合征的防治逡逑目前，ＰＲＲＳ在世界呈廣泛流行的趨勢(shì)（圖１－２），如何有效的防治ＰＲＲＳ，已成為世界逡逑養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。有關(guān)各國都在積極探索新的策略以控制ＰＲＲＳ，但成效并不顯著，給逡逑ＰＲＲＳ的防治工作造成困難的因素主要為免疫抑制、持續(xù)感染、亞臨床感染及容易繼發(fā)a|染逡逑等。因?yàn)闆]有特效藥物能治療ＰＲＲＳ，預(yù)防免疫仍是防控ＰＲＲＳ的有效措施，并對(duì)此寄予厚逡逑望�，F(xiàn)在預(yù)防本病的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒活疫苗。使用滅活疫苗免疫時(shí)，因誘導(dǎo)產(chǎn)生逡逑的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)期短，常需進(jìn)行多次免疫。與滅活疫苗相比之下，弱毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反逡逑應(yīng)持續(xù)時(shí)間更長，并且效果更好。但是，ＰＲＲＳＶ所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在引發(fā)自身免疫逡逑力和抵抗力、保護(hù)機(jī)體避免受到感染的同時(shí)，也可能造成病理過程、激化繼發(fā)感染，因此，逡逑有人形象地稱之為“雙刃劍”邋２４。逡逑３逡逑

色體的失活、基因印記、基因表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展均發(fā)揮著至關(guān)重要的作逡逑用。在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，基因組ＤＮＡ甲基模式得以建立與維持，并由甲基化ＣｐＧ逡逑結(jié)合蛋白識(shí)別甲基化信息。如圖１－４所示，哺乳動(dòng)物中常見ＤＮＡ甲基轉(zhuǎn)移酶主要分為Ｄｒｎｎｔｌ、逡逑Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ，其中Ｄｎｍｔｌ的功能主要是維持ＤＮＡ甲基化狀態(tài)，艮Ｐ以母本鏈甲基化信逡逑息為模板，建立ＤＮＡ半保留復(fù)制所產(chǎn)生的子代新鏈的甲基化模式５５；邋Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ的逡逑功能主要是使ＤＮＡ重新甲基化，即催化非甲基化的ＤＮＡ序列到從頭甲基化（ｄｅｎｏ逡逑ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）的發(fā)生５６。這些甲基化轉(zhuǎn)移酶在胚胎和嬰兒發(fā)育過程中是不可或缺的酶類，其逡逑中Ｄｎｍｔ３ａ基因還會(huì)對(duì)造血干細(xì)胞的分化造成影響，并且該基因敲除的小鼠在出生幾周后無逡逑法存活５７，５８。這些結(jié)果說明了邋ＤＮＡ甲基化在脊椎動(dòng)物分化發(fā)育過程中有著關(guān)鍵作用。逡逑８逡逑

圖１－５哺乳動(dòng)物典型的ＤＮＡ甲基化模式（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ邋＆邋Ｂｉｒｄ２００９）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｔｙｐｉｃａｌ邋ＤＮＡ邋ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ邋ｌａｎｄｓｃａｐｅ邋ｉｎ邋ｍａｍｍａｌｓ邋（Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ邋＆邋Ｂｉｒｄ邋２００９）逡逑基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化后，影響基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制主要有四種（圖１－６）：邋ａ）甲基基團(tuán)逡逑深入到ＤＮＡ雙螺旋大溝內(nèi)所造成的空間位阻能夠阻礙轉(zhuǎn)錄因子與識(shí)別序列的結(jié)合；ｂ）邋ＣｐＧ逡逑甲基化結(jié)合蛋白（ＭｅＣＰｌ、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２等）結(jié)合到甲基化ＣｐＧ位點(diǎn)，可以募逡逑集共抑制復(fù)合物到甲基化位點(diǎn)上，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄；ｃ）ＤＮＭＴ酶與組逡逑蛋白去乙酰化酶或組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶結(jié)合形成較為緊密的染色質(zhì)構(gòu)象而直接抑制轉(zhuǎn)錄；ｄ）逡逑甲基化ＣｐＧ結(jié)合蛋白結(jié)合在基因本體甲基化位點(diǎn)上，直接或通過影響相鄰染色質(zhì)構(gòu)象而阻逡逑礙轉(zhuǎn)錄的延伸６８。逡逑（ａ）邐（ｂ）逡逑（ｃ）邐Ａｃ邐（ｄ）逡逑［＼邋0ＮＭＴ邋Ｊｆ邋ｒ＾Ｈ３－Ｍｅ邐ｆ—？邐ＣＨ３逡逑＾ＣＨ３邐ｍｓ逡逑圖１－６邋ＤＮＡ甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制（Ｋｌｏｓｅ＆邋Ｂｉｒｄ邋２００６）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－６邋Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（Ｋｌｏｓｅ邋＆邋Ｂｉｒｄ邋２００６）逡逑１．２．２．３基因本體白勺ＤＮＡ甲基化逡逑大多數(shù)基因本體（ｇｅｎｅ邋ｂｏｄｙ）缺乏ＣｐＧ島，但其甲基化的現(xiàn)象卻廣泛存在�；虮倔w逡逑甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響目前還沒有明確的結(jié)論。基因本體內(nèi)，夕卜顯子的甲基化程度比內(nèi)含逡逑子較高

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Andrea K. PERRY;The host type I interferon response to viral and bacterial infections[J];Cell Research;2005年06期

本文編號(hào)：2831108