黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,簡(jiǎn)稱AFB1)是黃曲霉毒素(AF)中的一種,AFB1因其肝毒性強(qiáng)、危害大、分布廣而被列入一級(jí)致癌物。AFB1為前致癌物,進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)Ⅰ相藥物代謝酶催化代謝為黃曲霉毒素B1-8,9-環(huán)氧化物(AFBO),肝臟為其主要靶器官,可造成肝損傷,甚至誘發(fā)肝癌。肝臟結(jié)合解毒是消除代謝物毒性的主要方式,其中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是肝臟的主要解毒酶,而黃曲霉毒素B1-8,9-環(huán)氧化物-谷胱甘肽加合物(AFBO-GSH)是評(píng)價(jià)GST能否解毒AFB1的主要指標(biāo)之一。姜黃素(curcumin)是姜黃的活性成分,具有抗炎、抗氧化及提高機(jī)體免疫力等功效,可激活Nrf2-ARE通路對(duì)抗氧化應(yīng)激,但其作用機(jī)制尚不明確,尤其是姜黃素能否通過促進(jìn)肝臟的解毒機(jī)制干預(yù)AFB1的肝毒性未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇國(guó)內(nèi)飼養(yǎng)量大的Arbor Acres(AA)肉雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,從mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平、酶活性三個(gè)層次來探討AFB1對(duì)肉雞肝臟Nrf2和主要II相解毒酶表達(dá)的影響及添加姜黃素對(duì)AFB1造成上述影響的改變。并采用高效液相色譜法檢測(cè)加合物AFBO-GSH含量的變化以此來評(píng)價(jià)GST的解毒能力。本研究將闡明AFB1致肉雞亞急性肝損傷和姜黃素如何影響核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)及其下游靶基因GSTA家族與GSTM家族部分亞型(GSTA、GSTA3、GSTA4和GSTM2)、環(huán)氧化物水解酶1型(EPHX1)的表達(dá),從而緩解AFB1誘導(dǎo)的肉雞亞急性肝損傷作用。研究結(jié)果如下:1、AFB1和/或姜黃素對(duì)肉雞肝臟Nrf2及II相酶(GST、EPHX1)的影響本實(shí)驗(yàn)采用病理組織學(xué)切片法(HE染色)、RT-PCR和Western-Blot法,研究了飼料中連續(xù)添加AFB1(5 mg·kg~(-1))及不同劑量姜黃素(150 mg·kg~(-1)、300 mg·kg~(-1)和450 mg·kg~(-1))28d對(duì)AA肉雞肝臟Nrf2及相關(guān)II相解毒酶(GSTs、EPHX1)的影響。結(jié)果顯示,連續(xù)染毒28d,AFB1組肉雞Nrf2基因及蛋白表達(dá)極顯著低于空白對(duì)照組(P0.01);II相酶GSTA、GSTA3、GSTA4、GSTM2和EPHX1基因表達(dá)極顯著低于空白對(duì)照組(P0.01);GSTA3蛋白表達(dá)極顯著低于空白對(duì)照組(P0.01);病理組織切片結(jié)果顯示,AFB1組肉雞肝細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象嚴(yán)重,表明AFB1對(duì)肉雞肝臟造成損傷,而姜黃素干預(yù)組肉雞肝組織AFB1損傷癥狀被顯著緩解,且緩解程度與姜黃素劑量呈正相關(guān),表明姜黃素對(duì)AFB1誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用。姜黃素對(duì)照組與空白對(duì)照組相比各項(xiàng)指標(biāo)未見顯著差異(P0.05),說明添加的姜黃素濃度對(duì)肉雞無不良影響。與AFB1染毒組相比,中、高劑量姜黃素能夠極顯著提高Nrf2及II相酶GSTs、EPHX1基因的表達(dá)(P0.01);高劑量姜黃素能夠極顯著提高Nrf2、GSTA3及GSTM2蛋白的表達(dá)(P0.01),說明姜黃素是通過提高Nrf2及其下游II項(xiàng)酶通路的表達(dá)來抵抗AFB1誘發(fā)的氧化應(yīng)激及其肝損傷。停止染毒及姜黃素干預(yù)后第7d(即實(shí)驗(yàn)第35d),各組肝臟指標(biāo)變化趨勢(shì)與28d相似,AFB1組AA肉雞肝臟仍呈現(xiàn)明顯的肝損傷狀態(tài),高劑量姜黃素對(duì)AFB1誘導(dǎo)的AA肉雞亞急性肝損傷仍存在持續(xù)的保護(hù)作用。說明AFB1對(duì)肉雞肝臟Nrf2及II相酶(GST、EPHX1)的影響在停毒7d內(nèi)具有后遺毒性,而且姜黃素的干預(yù)作用在停藥7d內(nèi)有持續(xù)性。2、AFB1及姜黃素對(duì)肉雞肝臟GST活性及其催化AFBO解毒能力的影響連續(xù)染毒28d,與空白對(duì)照組相比,肉雞肝組織內(nèi)GST酶活性極顯著降低(P0.01),姜黃素干預(yù)組與AFB1組相比,GST酶活性有所提高但未見顯著差異。將肉雞肝微粒體分別與丁基羥基茴香醚(BHA)誘導(dǎo)小鼠肝胞液、對(duì)照組肉雞肝胞液、添加姜黃素肉雞肝胞液及不添加肝胞液放入緩沖液中進(jìn)行反應(yīng),采用高效液相色譜法對(duì)上清液中加合物進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果顯示僅在添加姜黃素的一組上清液中檢測(cè)到AFBO-GSH加合物。停毒停藥7d后,各組GST酶活性趨勢(shì)及AFBO-GSH加合物檢測(cè)結(jié)果與28d相似。說明姜黃素提高了肉雞肝組織GST酶活性,促進(jìn)谷胱甘肽(GSH)與AFBO的結(jié)合,從而起到解毒作用,并且其干預(yù)作用在停藥7d內(nèi)有持續(xù)性。以上結(jié)果表明,連續(xù)28d飼喂含有5 mg·kg~(-1) AFB1的飼料能夠造成AA肉雞亞急性肝損傷,且損傷不可逆;肉雞體內(nèi)共檢測(cè)到以下參與解毒的II相酶亞型:GSTA、GSTA3、GSTA4、GSTM2和EPHX1;姜黃素通過上調(diào)Nrf2及上述II相酶的表達(dá),促進(jìn)AFBO與GSH結(jié)合解毒改善AFB1誘導(dǎo)的肝損傷,以高劑量干預(yù)效果最佳,這是姜黃素緩解AFB1致AA肉雞肝損傷的作用機(jī)制之一。建議姜黃素混飼的干預(yù)劑量為450 mg·kg~(-1)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

圖 1-1 黃曲霉毒素 B1 的體內(nèi)代謝Fig. 1-1 The metabolism of AFB1 in body1.4 本研究目的與意義在前文介紹中提到，AFB1 經(jīng) I 相酶催化生成 AFBO，進(jìn)而發(fā)揮毒性。本研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索 AFB1 致 AA 肉雞亞急性肝損傷模型及 AFB1 染毒劑量，確立了在實(shí)驗(yàn)用雞建立制造肉雞亞急性肝損傷模型的染毒劑量為 5 mg·kg-1。在此基礎(chǔ)上，本課題組其他成員針對(duì)肉雞氧化 AFB1生成 AFBO 的 I 相酶進(jìn)行了深入研究，經(jīng)過研究證實(shí)在肉雞體內(nèi)能催化 AFB1 生成 AFBO 的 I 相酶主要有 CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6 和 CYP3A4。在 AFB1 致肉雞肝損傷后參與解毒的是 GST哪一種亞型，環(huán)氧化物水解酶能否有效參與解毒，以及 Nrf2 在其中是否有參與，這些都未見報(bào)道，并且在姜黃素干預(yù)后起到的緩解作用是否與 II 相酶相關(guān)，這些都是本研究中主要需要解決的問題。本課題以 Arbor Acres 肉雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立 AFB1 亞急性肝損傷模型并以高、中、低三種劑量姜黃素進(jìn)行干預(yù)，利用 Real-time PCR、Western Blot、高效液相色譜法、病理組織學(xué)分析、酶活性等分子生物學(xué)及現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)，觀察肝細(xì)胞病理變化，檢測(cè) Nrf2、GST 和 EPHX1 基因及蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)而探索 AFB1 致肉雞肝損傷后參與解毒的 GST 亞型、EPHX1 是否有參與解毒及Nrf2在其中扮演的角色，評(píng)價(jià)姜黃素在這一解毒過程中所起到的干預(yù)作用。本研究為AFB1

20注：紅圈為病變部位。圖 A 為空白對(duì)照組，圖 B 為 AFB1 染毒組；圖 C 為姜黃素對(duì)照組，圖 D 為姜黃素低劑量干預(yù)組，圖 E 為姜黃素中劑量干預(yù)組，圖 F 為姜黃素高劑量干預(yù)組。Note: The red ring refers to the lesion sites. A represents control group, B represents AFB1 group. C represents curcumincontrol group, D represents curcumin high dose group, E represents curcumin medium dose group, F represents curcuminlow dose group.圖 3-1 28 d 各處理組 AA 肉雞肝臟病理組織學(xué)切片（HE 染色，400×）Fig. 3-1 Histological section of six groups’ AA broilers on 28th day（HE staining, 400×）

21注：紅圈為病變部位。圖 A 為空白對(duì)照組，圖 B 為 AFB1 染毒組；圖 C 為姜黃素對(duì)照組，圖 D 為姜黃素低劑量干預(yù)組，圖 E 為姜黃素中劑量干預(yù)組，圖 F 為姜黃素高劑量干預(yù)組。Note: The red ring refers to the lesion sites. A represents control group, B represents AFB1 group. C represents curcumincontrol group, D represents curcumin high dose group, E represents curcumin medium dose group, F represents curcuminlow dose group.圖 3-2 35 d 各處理組 AA 肉雞肝臟病理組織學(xué)切片（HE 染色，400×）Fig. 3-2 Histological section of six groups’ AA broilers on 35th day（HE staining, 400×）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2831028