為獲取羊口瘡病毒B2L基因編碼蛋白,本研究根據(jù)GenBank上羊口瘡病毒ORFV/ShanXi/2011/China株B2L基因序列,設(shè)計(jì)并合成—對特異性引物,利用PCR方法擴(kuò)增ORFV/QD/2015株B2L基因,并將擴(kuò)增的B2L基因克隆到PMD18-T載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒(PMD18-T-B2L)。應(yīng)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件及方法對所得的基因進(jìn)行序列分析,并對其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位、三級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽等進(jìn)行預(yù)測和分析。最后將目的基因亞克隆到PET-32a(+)載體上,獲得重組質(zhì)粒PET-32a-B2L,通過雙酶切和測序進(jìn)行鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。將重組菌于37℃、終濃度含1mM IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)3h后進(jìn)行SDS-PAGE分析,表達(dá)的目的蛋白經(jīng)過層析純化后,進(jìn)行Western Blot鑒定。結(jié)果顯示,ORFV/QD/2015株B2L基因序列長1137 bp,編碼379個(gè)氨基酸;該毒株與國內(nèi)外其他12株羊口瘡病毒參考株的B2L基因核苷酸序列同源性為96.8%-99.7%,氨基酸序列同源性為96.8%-99.2%;B2L基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,ORFV/QD/2015 株與 2015 年分離到的 ORFV/ShaanXi/2015/China 株親緣關(guān)系最近;B2L基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋區(qū)域和β—折疊區(qū)域所占比例較大,預(yù)測此蛋白可能存在7個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位,無跨膜區(qū)域,無信號肽區(qū)域;三級結(jié)構(gòu)呈彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)。原核表達(dá)載體PET-32a-B2L構(gòu)建成功;SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)目的條帶的分子量與預(yù)期大小相符;純化的目的蛋白經(jīng)Western Blot鑒定正確,表明蛋白表達(dá)成功。本研究成功構(gòu)建了羊口瘡病毒B2L基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒,并成功表達(dá)和純化了 B2L蛋白,為后續(xù)羊口瘡病毒檢測方法的建立打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

副痘病毒和牛丘疹性口炎病毒等［４］。羊口瘡病毒經(jīng)過１邋％的磷鎢酸負(fù)染后，通過透射逡逑電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)病毒粒子比較大，長２５０－２８０邋ｎｍ，寬１７０－２００邋ｎｍ％大多數(shù)呈橢圓形的逡逑線團(tuán)樣，也有磚型、維形和特殊的線團(tuán)樣球形粒子，如圖１所示。在超薄切片中，病逡逑毒粒子的外層被較厚的囊膜包裹著，內(nèi)部是卵圓形或者圓錐形核心，核心兩側(cè)是側(cè)體，逡逑如圖２所示。常可以在感染的細(xì)胞胞漿中看到病毒粒子被較厚的雙層囊膜包裹，表面逡逑呈“８”字型螺旋狀結(jié)構(gòu)Ｍ］。逡逑［ｍｕＢ逡逑ｍｍ逡逑ＥＷｉｐ＾逡逑圖１病毒粒子在透射電鏡下的形態(tài)（６００００Ｘ）（引自２０１６年涂明亮論文）逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ＯＲＦＶ－Ｑ邋Ｖｉｒｕｓ邋ｐａｒｔｉｃｌｅｓ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋（６００００邋ｘ）逡逑

３．邋６邋０ＲＦＶ／ＱＤ／２０１５株Ｂ２Ｌ基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測逡逑運(yùn)用ＤＮＡＳｔａｒ程序中的Ｐｒｏｔｅａｎ軟件，使用Ｇａｍｉｅｒ－Ｒｏｂｓｏｎ和Ｃｈｏｕ－Ｆａｓｍａｎ兩種逡逑方法，對ＯＲＦＶ／ＱＤ／２０１５株Ｂ２Ｌ基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖１１。逡逑由圖１１可知，不同預(yù)測方法對蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果不完全相同，Ｐ－折疊和Ｐ－轉(zhuǎn)逡逑

２４邐羊口瘡病毒Ｂ２Ｌ基因原核表達(dá)及純化邐逡逑邐邐邐邐邐邐ｔ邐！邐，邐，邐，邐，邐，邐，邐１邐，邐，■邐！邐１邐１邋Ｐ＆Ｓ３＞ｅ逡逑－ＴＳＤ邋２－Ｘ＇邋２２＞邐２４０邐２Ｓ０邐Ｋ＞５邋３２Ｓ邐３４３邐３＜Ｄ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2830676