豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又叫“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種烈性傳染病,在臨床上主要表現(xiàn)妊娠母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸道癥狀�，F(xiàn)今豬場PRRSV多類型毒株感染較為普遍,主要有PRRSV疫苗毒株、野毒株、重組毒株和類NADC30毒株,毒株的多樣性使得對該病的防控舉步維艱。迄今為止,PRRSV已經(jīng)在我國流行二十幾年,但仍然未得到有效的控制,給我國生豬業(yè)的發(fā)展帶來了難以估計的經(jīng)濟損失。本試驗從疑似PRRSV感染的豬場分離并鑒定2株P(guān)RRSV毒株,進行全基因序列分析,在mRNA水平探究PRRSV貴州分離株對解旋酶DDX6、Mov10的影響。為初步了解貴州局部地區(qū)PRRSV感染以及毒株變異情況提供參考,也為進一步研究解旋酶DDX6、Mov10與PRRSV增殖的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。1.PRRSV貴州分離株GZZJ11、GZBJ12的分離與鑒定。試驗對疑似PRRSV感染豬的臟器組織進行PRRS病毒分離與鑒定。取病料進行研磨、離心、除菌過濾處理后,接種于Marc145細(xì)胞,進行病毒分離;通過CPE觀察、RT-PCR、IFA和Western blotting等方法對分離病毒進行鑒定。結(jié)果表明:(1)GZZJ11株在Marc145細(xì)胞上盲傳至第6代后能觀察到Marc145細(xì)胞出現(xiàn)聚團、皺縮等明顯CPE,GZBJ12盲傳至第3代后也能觀察到相同CPE。(2)在分離病毒GZZJ11株和GZBJ12株分別盲傳第6代、第3代時,RT-PCR檢測到與預(yù)期相符的372 bp的N基因條帶,以及931 bp的NSP2基因條帶。(3)用基因2型PRRSV抗N蛋白的兔源多抗進行IFA和Western blotting試驗鑒定分離毒,IFA結(jié)果顯示感染病毒組能看到特異性的綠色熒光;Western blotting結(jié)果表明PRRSV感染組在15 kDa處出現(xiàn)特異性條帶,未感染組無特異性條帶。(4)GZZJ11第6代細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID_(50)值為10~(-2.2)/0.1 mL,GZBJ12第3代細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID_(50)為10~(-4.67)/0.1 mL。結(jié)果表明本試驗成功分離鑒定出2株P(guān)RRSV,并命名為GZZJ11和GZBJ12,為后續(xù)進一步研究PRRSV相關(guān)特性奠定基礎(chǔ)。2.PRRSV貴州分離株GZZJ11、GZBJ12全基因序列分析。采用PrimerSelect軟件針對PRRSV的全基因保守區(qū)域設(shè)計13對引物,分別對2株毒株的13個基因片段進行RT-PCR、克隆至pMD-19T載體、測序、拼接,得到2株P(guān)RRSV毒株的全基因序列(去除polyA尾),采用Lasergene軟件包、MEGA7.0對2株毒株的全基因序列進行比對分析。(1)RT-PCR檢測到與預(yù)期大小基本相符的13個基因目的條帶;拼接后分別獲得GZZJ11和GZBJ12毒株全長基因組序列為15323 bp、14963 bp;全基因核苷酸比對結(jié)果表明2株毒株的全基因序列與基因1型毒株同源性在60%左右,與基因2型毒株同源性在82%以上,與HP-PRRSV代表株JXA1、HUN4、TJ核苷酸同源性在98.8%~99.2%之間。(2)2株毒株非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白基因變異分析結(jié)果表明NSP2、NSP9、ORF3、ORF4和ORF5基因均有不同程度的變異,其中NSP2基因變異最大。GZZJ11株和GZBJ12株的NSP2基因分別有24、23個氨基酸突變,均有1+29個氨基酸不連續(xù)缺失,缺失位置與HP-PRRSV缺失位置一致。GZBJ12株NSP2基因除了有30個不連續(xù)氨基酸缺失外,在下游還存在120個氨基酸連續(xù)缺失,提示GZBJ12株可能演變于HP-PRRSV TJ致弱疫苗毒株TJM。(3)毒力位點分析結(jié)果表明2株毒株位于ORF5的毒力位點151位氨基酸發(fā)生了相應(yīng)突變,這一位點的突變與我國分離的類NADC30毒株CHsx1401、FJXS15毒株突變一致,也與新分離的TJnh1501、GDHY、XJu-1毒株的毒力位點相同。(4)基于NSP2、ORF5以及全基因核苷酸序列遺傳進化樹結(jié)果表明GZZJ11株與TJnh1501、HENZZ-8等基因2型毒株遺傳進化關(guān)系較近,GZBJ12株與GDHY、XJu-1等基因2型毒株遺傳進化關(guān)系最近,這與全基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果基本一致。試驗結(jié)果為初步了解貴州局部地區(qū)PRRSV感染以及毒株變異情況提供參考。3.PRRSV貴州分離株GZZJ11、GZBJ12對解旋酶DDX6、Mov10的影響。通過RT-PCR從Marc145細(xì)胞中擴增DDX6、Mov10基因CDS區(qū),并對DDX6基因CDS區(qū)進行克隆和生物信息學(xué)分析;利用q-PCR方法在mRNA水平檢測貴州分離PRRSV在不同時間段感染Marc145細(xì)胞后對解旋酶DDX6和Mov10基因的影響。結(jié)果表明:(1)Marc145細(xì)胞源DDX6基因CDS全長1452 bp,編碼483個氨基酸;DDX6蛋白有四個基序,含有DEAD-like解旋酶超家族結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域;二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋(37.27%)和無規(guī)則卷曲(36.44%)為主;同源性及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明Marc145細(xì)胞源與人DDX6核苷酸同源性最高,親緣關(guān)系最近。(2)q-PCR結(jié)果表明2株P(guān)RRSV感染Marc145細(xì)胞6 h后DDX6基因mRNA水平升高,在36 h時段差異顯著;PRRSV感染Marc145細(xì)胞0 h、6 h、36 h和72 h時段Mov10基因轉(zhuǎn)錄水平下降,其它時段Mov10基因轉(zhuǎn)錄水平升高。說明貴州分離株P(guān)RRSV對解旋酶DDX6、Mov10轉(zhuǎn)錄水平具有一定影響。試驗為進一步探究解旋酶DDX6、Mov10與PRRSV增殖的關(guān)系提供了參考。
【學(xué)位單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

遺傳分析結(jié)果表明此次流行毒株可能是由經(jīng)典毒株演化而來(LI Y, et a2007；Zhou L, et al., 2009)。類 NADC30 毒株以 NSP2 基因存在 131 個氨基酸不連續(xù)缺失為特征(“111＋1＋19”缺失模式)，與 2008 年美國分離到 NADC30 毒株類似，因此將該類毒株命名為類 NADC30(NADC30-like)(Brockmeier S L, et al., 2012)。2014 年，周峰等(2014)首次報道了類 NADC30 在河南地區(qū)流行。隨后在我國大部分地區(qū)都有類NADC30 毒株報道，且與美國的高毒力毒株 NADC30 高度同源(Zhou L, et al., 2015)，后又有多個地方有重組 NADC30 毒株的報道(Wang L J, et al., 2015)。表明類 NADC30 毒株和重組 NADC30 毒株逐漸成為我國田間流行毒株(安同慶,2017)，目前一致的看法是類NADC30 毒株是由美國傳入并經(jīng)歷了一定時間演化而來。高嘉聰(2018)基于 NCBI 多條序列對全國 32 個省份基因 2 型 PRRSV 流行情況進行系統(tǒng)分型和地域分布分析，發(fā)現(xiàn)我國基因 2 型 PRRSV 可分為 5 個分支，HP-PRRSV 代表株位于第 8 個分支，而貴州省的主要流行毒株也是在第 8.3 分支，見圖 1。

圖 2 PRRSV 基因組結(jié)構(gòu)示意圖(Lunney J K, et al., 2016)Fig.2 Schematic diagram of the PRRSV genome structure (Lunney J K, et al., 2016)4 PRRSV 主要蛋白及其功能4.1 PRRSV 主要非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能PRRSV 的 NSP1 是最早產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白，不同型的 PRRSV 氨基酸的種基因 1 型有 385 個氨基酸，基因 2 型有 380 個氨基酸。NSP1 蛋白是一種多功該蛋白經(jīng)自剪切后形成 NSP1α和 NSP1β，NSP1α和 NSP1β蛋白含有兩個類木(Papain-like cysteine protease，PCP)，除此之外，NSP1 還包括了亞基因組 mRN需的鋅指結(jié)構(gòu)域。隨著 NSP1α和 NSP1β的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，已經(jīng)確定了NSP1β之間的自剪切位 Trp-Try-Gly203↓Ala-Gly-Lys(薛飛,2011)。NSP1 在 PRRS程中扮演著重要作用，目前報道 NSP1 蛋白可以通過 3 個不同環(huán)節(jié)或通路影響素的表達和產(chǎn)生，分別為 NSP1 抑制 IκB 的磷酸化而抑制 NF-κB(nuclear factor

圖 3 SF1 和 SF2 解旋酶家族蛋白結(jié)構(gòu)與其保守基序(徐峰等，2014)Fig 3 Structure of SF1 and SF2 helicases and their conserved motifs (Xu F, et al., 2014).2 DDX6 生物學(xué)功能DDX6(又稱 RCK/p54)屬于 RNA 解旋酶超家族-2(SF-2)成員，也是 DEAD-box 解旋家族成員之一。DDX6 在 RNA 代謝、病毒復(fù)制、神經(jīng)干細(xì)胞、泌乳、癌癥、激素調(diào)等過程中發(fā)揮著重要作用。DDX6 在真核生物中具有結(jié)構(gòu)和功能保守性。在結(jié)構(gòu)上，DX6 蛋白由兩個 RecA 結(jié)構(gòu)域組成，含有對 ATP 酶和 RNA 結(jié)合活性至關(guān)重要的解旋基序，Brandmann T 等(2018)研究表明 DDX6 蛋白的 RecA 結(jié)構(gòu)域可與天然免疫分子SM14 的 FDF 基序結(jié)合介導(dǎo) mRNA 沉默復(fù)合體的組裝。DDX6 定位于 P-Body，可與SM14、4E-T、PATL1、EDC3 等蛋白分子發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié) RNA 代謝(Ozgur S, et al.,015)。關(guān)于 DDX6 蛋白與病毒相關(guān)研究主要集中在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、

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