產(chǎn)仔數(shù)是豬繁殖性狀一個重要的經(jīng)濟性狀,是反應(yīng)豬場生產(chǎn)水平和經(jīng)濟效益的重要指標。卵巢是母豬重要的生殖器官,在每個發(fā)情周期都經(jīng)歷一系列的生物學(xué)過程,卵巢中包含編碼基因和非編碼基因的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)緊密調(diào)控著母豬的產(chǎn)仔。但這些影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的分子調(diào)控機理仍不明晰。本課題選擇豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是抗原陰性的高產(chǎn)仔數(shù)(LLS,larger litter size)和低產(chǎn)仔數(shù)(SLS,smaller litter size)大白長白二元雜交母豬為研究對象,利用卵巢全轉(zhuǎn)錄組測序(RNA Sequencing,RNA-seq)以及卵巢代謝組學(xué)分析策略,篩選與母豬高產(chǎn)性狀相關(guān)的關(guān)鍵候選基因、microRNA、circRNA、lncRNA、代謝物、GO條目和KEGG通路,建立初步的影響母豬產(chǎn)仔數(shù)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系。然后,通過用RT-qPCR、EdU染色實驗、CCK-8實驗、Western Blot、流式細胞檢測和雙熒光素酶檢測等方法對該分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系中重要節(jié)點miR-183-circTCP1軸進行體外功能驗證,深入研究影響母豬產(chǎn)仔數(shù)的分子調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:1、基于卵巢全轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選影響母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)鍵候選基因本研究對LLS組和SLS組大白長白二元雜母豬卵巢進行去核糖體RNA的高通量測序。每個樣本得到約1億clean reads,與豬參考基因組匹配率最高為96.3%,最低為94.1%。在LLS組較SLS組卵巢組織中鑒定出2708個差異表達基因,其中上調(diào)的差異表達基因有1110個,下調(diào)的差異表達基因有1598個。通過GO和KEGG分析得到15個STAR、HSD17B2、HSD17B12、BMP6、BMP4、INHBA、BMP2、GDF7、TGFBR1、TGFB3、BMP7、AKR1C1、CYP21A2、GDF5和HSD17B8可能影響豬產(chǎn)仔數(shù)的候選基因,富集在Hippo信號通路、TGF-beta信號通路、類固醇激素合成和卵巢甾類激素合成4條對產(chǎn)仔數(shù)有影響的通路。其中在LLS組較SLS組的卵巢組織中,上調(diào)的差異表達基因有STAR、HSD17B2、HSD17B12、INHBA、TGFBR1、AKR1C1,下調(diào)的差異表達基因有BMP6、BMP4、BMP2、BMP7、GDF5、GDF7、TGFB3、CYP21A2、HSD17B8。2、基于卵巢全轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選影響豬產(chǎn)仔數(shù)的非編碼RNA利用RNA-seq,在LLS組較SLS組的卵巢組織中篩選出差異表達的miRNA、lncRNA和circRNA分別為33、302和548個,并挑選了在LLS組和SLS組間表達量差異顯著,且與卵巢發(fā)育、卵巢類固醇激素合成相關(guān)非編碼RNA進行了RT-qPCR的驗證。構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),找到影響豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵候選miRNA 2個(miR-183、miR-1343)、關(guān)鍵候選lncRNA 4個(LOC110259814、LOCLOC106504714、LOC106505099和LOC110257180)、關(guān)鍵候選circRNA7個(circ-TCP1、circ-PAN3、circ-DDX19B、circ-LOC106505137、circ-ANKRD12、circ-SNX25和circ-SLA-5)。3、基于卵巢代謝組學(xué)篩選影響豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)鍵代謝物及其候選基因主要利用代謝組學(xué)對LLS和SLS兩組豬的卵巢組進行了代謝產(chǎn)物的分析,最終得到55個差異代謝產(chǎn)物,并主要富集在18條差異的通路上。在這18條差異通路上,多條通路共有的關(guān)鍵代謝物有:苯胺、組胺和1-哌啶,影響這三個代謝物的關(guān)鍵候選基因主要有6個(ANXA8、LOC100524773、LOC110258110、DDO、,SMIM1和AZGP1)。其中組胺富集在FcεRI信號通路上。這些重要的節(jié)點可能是影響豬產(chǎn)仔性能的潛在因素。4、miR-183在高產(chǎn)性母豬卵巢中的功能和miR-183-circTCP1軸的鑒定(1)miR-183能促進豬卵巢顆粒細胞(GCs)的增殖,對GCs凋亡沒有顯著的影響。(2)miR-183在細胞S期,抑制了顆粒細胞雌二醇(E2)的合成而促進了孕酮(P4)的合成,3β-HSD是P4合成過程中的關(guān)鍵功能基因,Cyp19a1是E2合成過程中的關(guān)鍵功能基因。(3)miR-183在LLS組水平顯著上調(diào),較SLS組產(chǎn)生優(yōu)勢卵泡顆粒細胞,促進卵泡的發(fā)育,從而提高豬產(chǎn)仔數(shù)。(4)circ-TCP1可能作為ceRNA競爭性吸附miR-183,在母豬高產(chǎn)性相關(guān)的生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

學(xué)（檢測樣品中代謝分子的相對含量，盡可能鑒定所有代謝物）、廣泛靶向代代謝物進行準確地定量和定性）等。目前，代謝組學(xué)分析主要分為以下幾個樣品的準備和制備；（2）數(shù)據(jù)的采集和處理；（3）代謝途徑的推測和解析等析技術(shù)平臺是決定代謝組學(xué)的成敗的關(guān)鍵。隨著技術(shù)平臺的發(fā)展，代謝組學(xué)統(tǒng)的核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR），高通量、高精確度的ss spectrometer，MS）以及現(xiàn)在運用比較多的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用matography-mass spectrometry，GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high perforid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)。Goldansaz 等詳細的同技術(shù)平臺的靈敏度和檢測覆蓋范圍（如圖 3-2）(Goldansaz et al., 2017)不敏感，僅限于測量毫摩爾（mM）到微摩爾（μM）濃度范圍內(nèi)的代謝物。而可以檢測到納摩爾（nM）至皮摩爾（pM）濃度之間的代謝物，從而可以檢測代謝產(chǎn)物。Dharuri H 等研究表明，MS 可以檢測到包括糖醇、脂肪酸、氨基括大量的次級代謝分子在內(nèi)的數(shù)百種化學(xué)性質(zhì)不同的化合物(Dharuri et)。由于 GC-MS 只有具有揮發(fā)性的物質(zhì)方可使用，因此在樣品預(yù)處理顯得更為繁用范圍也受到一定的限制。因此 LC-MC 技術(shù)更廣泛的應(yīng)用于各類研究中。

圖 2-1 凝膠電泳檢測豬卵巢總 RNA 質(zhì)量Fig.2-1Detection of total RNA quality in porcine ovaries by gel electrophoresis2.2.2 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制RNA 測序后，使用 Fast-QC（網(wǎng)址：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk）對原始數(shù)據(jù)進行整體的評估，包括堿基質(zhì)量分布、GC 含量分布等。如圖 2-2 所示，質(zhì)量分數(shù)值大于 30 表示測序堿基準確度大于 99.9%。從圖 2-2 中可以看出，所測樣品中高產(chǎn)仔數(shù)豬分別為 92.56%、92.40%和 82.21%，低產(chǎn)仔數(shù)豬為 90.21%、92.46%和 78.43%。因此，本次測序的堿基質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)研究。

圖 2-2 樣品 SLS1/2/3 和 LLS1/2/3 的堿基測序準確性Fig.2-2 Base sequencing accuracy of samples SLS1/2/3 and LLS1/2/3接下來我們檢測了樣品中的 GC 含量的分布情況，如圖 2-3 所示，高產(chǎn)豬和低產(chǎn)豬中實際線條分布于正態(tài)分布接近，說明測序結(jié)果較好，可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

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本文編號：2828809