發(fā)布時(shí)間：2020-09-28 07:30

　　 奶牛性控冷凍精液人工授精的性控繁育技術(shù)可以快速增加良種奶牛數(shù)量,提升奶牛養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益,是目前奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用最成功、最有效的繁育生物技術(shù)手段。奶牛缺陷精子包括形態(tài)畸形與頂體破損、DNA缺陷、死精子三種類(lèi)型。奶牛精液中的缺陷精子直接影響奶牛種公牛遺傳資源利用率、性控冷凍精液生產(chǎn)效率及其人工受精的受胎率。本研究旨在通過(guò)特異性蛋白鑒別三種奶牛精液中的缺陷精子,然后與免疫磁珠結(jié)合在X"Y精子性控分離前去除缺陷精子,提高奶牛性控冷凍精液生產(chǎn)效率及產(chǎn)品中的正常精子比例,促進(jìn)該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用效果,同時(shí)為人工輔助生殖等相關(guān)方面的研究和應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究共分兩部分:第一部分為畸形與頂體破損、DNA缺陷奶牛精子的鑒別及結(jié)合免疫磁珠方法的奶牛精液中缺陷精子去除技術(shù)研究。首先分析確認(rèn)奶牛精子泛素化水平同精子畸形及精子DNA缺陷的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過(guò)western blotting和單通道流式細(xì)胞法檢測(cè)均證明奶牛精子泛素化水平同精子畸形率具有顯著相關(guān)性(p0.05);進(jìn)一步通過(guò)雙通道流式細(xì)胞法檢測(cè)結(jié)果表明,奶牛精子泛素化水平同精子DNA缺陷水平具有顯著相關(guān)性(p0.05)。在此基礎(chǔ)上,選擇抗泛素化蛋白作為特異抗體,設(shè)計(jì)了結(jié)合免疫磁珠抗泛素化蛋白去除奶牛精液中的畸形與頂體破損、DNA缺陷精子的技術(shù)流程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該技術(shù)流程可以有效去除奶牛精子中的畸形和頂體破損精子(p0.05)。結(jié)論:利用特異性抗泛素化蛋白與免疫磁珠結(jié)合,可以在X"Y精子性控分離前明顯去除奶牛精液中的畸形和頂體破損缺陷精子,提高奶牛性控冷凍精液產(chǎn)品質(zhì)量。第二部分為奶牛死精子與膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)的特異性結(jié)合確認(rèn)及免疫磁珠方法去除奶牛死精子的應(yīng)用技術(shù)研究。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,Annexin V可以與奶牛死精子進(jìn)行特異性結(jié)合。據(jù)此選擇Annexin V作為奶牛死精子的特異標(biāo)記,然后設(shè)計(jì)利用免疫磁珠結(jié)合Annexin V去除奶牛精液中死精子的技術(shù)流程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分選后精子的活力、膜完整性、線粒體活性和X"Y分離死精率均有不同幅度的改善,說(shuō)明該技術(shù)流程設(shè)計(jì)可以有效去除部分死精子,但是對(duì)于分離后的X或Y精子制備的性控冷凍精液各項(xiàng)指標(biāo)均沒(méi)有明顯影響(p0.05)。結(jié)論:利用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)的特異性結(jié)合免疫磁珠方法可以有效去除奶牛精液中的死精子,顯著降低性控分離時(shí)的奶牛精子死精率(p0.05),有效提高奶牛性控冷凍精液生產(chǎn)效率、降低了生產(chǎn)成本,推動(dòng)了該產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S823
【部分圖文】：

內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文2.12 精子膜完整性檢測(cè)加80μL現(xiàn)配的6-CFDA/PI染色液至20μL 精液樣品中，然后37℃水浴鍋避光溫育10min。孵育后 800g 離心 5min。然后取 30μL 的 0.01M PBS 重新懸浮，用移液器吸取取 15μL 精子混合液到干凈載玻片上，蓋玻片壓片，熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)精子所染熒光顏色差別判斷精子膜是否完整，每個(gè)樣品計(jì)數(shù) 200 個(gè)以上精子。被 6-CFDA 完全染成綠色的膜完整精子（FITC 濾光片下觀察）；被 PI 染成紅色的膜破損精子（Rcodamine 濾光片下觀察）；精子膜完整性 =總精子數(shù)膜完整精子數(shù)×100%

內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文2.13 精子線粒體活性檢測(cè)加 80μL 現(xiàn)配的 MITO 染色液至 20μL 精液樣品中，37℃水浴鍋避光溫育 20min，然后在以上精液混合液中加入 500μL PBS 緩沖液，500g 離心 5min 后棄掉上清。然后取 30μL 0.01MPBS 重新懸浮，吸取 10μL 混合液到干凈載玻片上，蓋玻片壓片于熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)精子尾部中段線粒體區(qū)域是否有紅熒光辨別精子是否具有線粒體活性，每樣本計(jì)數(shù) 200 個(gè)以上精子。精子線粒體活性 =總精子數(shù)具有線粒體活性精子數(shù)×100%

內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文然后用加一定量 PBS 溶液重懸，調(diào)整精子濃度至 1～2×106/mL。移液槍吸取 40μL 精子懸液涂片，空氣中自然干燥，用純甲醇固定 10 min，接著加入 50μL FITC-PNA 染液，37℃、陰暗潮濕環(huán)境下孵育至少 30 min 后用 PBS 溶液小心沖洗載玻片，待自然干燥后，加一定量增光劑并用無(wú)色指甲油封片。在 1000×熒光顯微鏡下鏡檢，通過(guò)熒光觀察頂體形態(tài)以判斷精子頂體是否完整。每次檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù) 200 個(gè)精子。精子頂體完整率 =總精子數(shù)頂體完整精子數(shù)×100%

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