豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是嚴(yán)重危脅到全球養(yǎng)豬業(yè)的傳染性疾病,其病原體是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2、nsp3和nsp5是跨膜蛋白。為了探究這幾個(gè)跨膜蛋白在病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(RTC)形成中的作用,本研究篩選并鑒定了與這三個(gè)跨膜蛋白存在相互作用的非結(jié)構(gòu)蛋白。首先采用酵母雙雜交技術(shù)(Y2H),篩選出與nsp2、nsp3和nsp5有相互作用的蛋白,然后用雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)驗(yàn)證了這些存在相互作用的蛋白,以去除假陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)Y2H和BiFC,檢測(cè)到nsp9、nsp12和跨膜蛋白nsp3、nsp5與多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白有相互作用,表明這些非結(jié)構(gòu)蛋白可能充當(dāng)RTC形成的核心組分。最后使用Pull-down技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證其中的部分蛋白間的相互作用。包含預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域的疏水性非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2、nsp3和nsp5被認(rèn)為涉及膜修飾和雙層膜囊泡(DMV)的形成,這是由動(dòng)脈炎病毒感染誘導(dǎo)的典型結(jié)構(gòu)。在PRRSV的3種跨膜的非結(jié)構(gòu)蛋白之間,我們發(fā)現(xiàn)nsp2與nsp3、nsp5與nsp3存在相互作用,并且nsp3自身也可以相互作用,因此推測(cè)這三種PRRSV跨膜蛋白可能在病毒復(fù)制過(guò)程中形成膜結(jié)合的nsp2-nsp3(×n)-nsp5復(fù)合體,即以nsp3為中心,nsp2和nsp5為側(cè)翼形成一個(gè)錨定在DMV膜上的一個(gè)支架,為復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成起到招募非結(jié)構(gòu)蛋白,并給以nsp9和nsp12為中心的RTC結(jié)構(gòu)提供支撐,從而參與病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

其在病毒感染中的功能仍然未知。通過(guò)內(nèi)部切割位點(diǎn)，nsp7 可以進(jìn) 步切割成 nsp7α 和 nsp7β，然而，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和放射免疫沉淀法僅在 PRRSV 感染的細(xì)胞中檢測(cè)到切割的 nsp7α。雖然基于結(jié)構(gòu)的反向遺傳學(xué)研究已經(jīng)證明 nsp7 在動(dòng)脈病毒 RNA合成中起重要作用（Ioannis Manolaridis et al. 2011; Zhang et al. 2013），但它的特定功能還不清楚。作為病毒 RNA 合成的關(guān)鍵酶，nsp9 被認(rèn)為是病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（RTC）的核心成分，具有很高的保守性（Li,Yetal.2014）。所以，在病毒復(fù)制過(guò)程中，nsp9 具有很重要的作用（Dong,Jetal.2014）。RdRp 結(jié)構(gòu)域位于 nsp9 的 C 端部分，蛋白質(zhì)的 N端部分被鑒定為與病毒 RdRp 相關(guān)的核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（LongLiuetal.2016）,在所有的正鏈 RNA 病毒中 RdRp 是病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄所必須的（O'ReillyEK1998）。nsp10 行使核酸解旋酶功能（YingFangandEricJ.Snijder2010），nsp11 具有對(duì)內(nèi)源性核糖核酸酶活性的抑制作用（Terje Dokland 2010），這種抑制作用可以抑制 NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的 IL-1β 誘導(dǎo)（Wang Chao et al. 2015; Bautista et al.2002; Seybert et al. 2005），有研究表明，nsp11 也是以二聚體的形式存在（Shi et al. 2016）。nsp12 則可能與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合蛋白存在相互作用（Dong et al. 2016）。

第二章 酵母雙雜技術(shù)篩選與 PRRSV 跨膜 nsp 的互作蛋白9表 2-1 引物名稱與序列Table 2-1 Prime name and sequence引物名稱（Prime name） 引物序列（Prime sequence）NdeINSP2-F GGAATTCCATATGGCTGGAAAGAGAGCAAGGBamHINSP2-R CTAAGGATCCGGGTAAGTCAGCACCACCNdeINSP3OD1-F GGAATTCCATATGTATGTAACTGCAGTGGGGTCBamHINSP3OD1-R CATAGGATCCCACAAGTGCTGTCAAGGGCNdeINSP3OD2-F GGAATTCCATATGCGTTATACTAATGTTGTTGGTCBamHINSP3OD2-R GAATGGATCCCTCAAGAAGGGACCCAAGNdeINSP5OD1-F GGAATTCCATATGGGACATGCCTGGACGBamHINSP5OD1-R CACGGGATCCTCTGTTCCTGTTAAGAGNdeINSP5OD2-F GGAATTCCATATGGCAACTCAAGGGCACCCGBamHINSP5OD2-R ATTAGGATCCCCGAGGCAGGAAGGCATAG

圖 2-2 感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化流程圖Fig.2-2 Process for the preparation and transformation of bacterial competent cells2.2.3 陽(yáng)性 隆的鑒定從平板上隨機(jī)挑取 3 個(gè)單克隆，進(jìn)行菌落 PCR，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將陽(yáng)性結(jié)果的單菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素的 LB 液體中，過(guò)夜培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ和 NdeⅠ進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)總體積為 20μL，酶切體系參照表 2-3。酶切結(jié)果用 1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。電泳檢測(cè)后的重組質(zhì)粒，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。2.2.4 制備與轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài) 胞酵母感受態(tài)的制備嚴(yán)格按照 Clontech 公司的酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 2 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在此不再贅述。取 1.5mL 的離心管依次加入表 2-5 中的成分，混合均勻后，于 30℃、150rpm 培養(yǎng)至少 30min，避光條件下加入 20μL 的 DMSO，混合均勻后，于 42℃下，水浴 15min，每隔 5min 輕搖 次，6000rpm 離心 15s，棄上清，使用 200μL0.9%的生理鹽水重懸后，涂布于二缺培養(yǎng)基上。酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化的主要實(shí)驗(yàn)流程，如圖 2-3 所示。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 吳加強(qiáng),姜平;豬繁殖與呼吸綜合征[J];畜牧與獸醫(yī);1999年S1期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 許傲天;高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp4的表達(dá)與功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

2 陳靜;重慶市部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因的遺傳變異分析[D];西南大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2829029