戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是感染人類后引起肝臟疾病的一種人畜共患性病毒,在自然界中具有廣泛的宿主來源。豬被認(rèn)為是HEV的重要貯存宿主,主要包括基因3和4型,與人HEV的同源性可達(dá)80%-90%。豬HEV可以通過食源性或水源性途徑傳播給人類,因此阻斷豬HEV傳播具有重要的公共衛(wèi)生意義。HEV ORF2編碼病毒衣殼蛋白,不僅保證病毒基因組的完整性,還參與病毒多項(xiàng)重要生理活動;HEV ORF2上具有主要的抗原表位區(qū),是關(guān)鍵的疫苗研發(fā)靶區(qū)。實(shí)驗(yàn)室前期原核表達(dá)的豬HEV ORF2截短蛋白(sORF2-C,aa 393-660),經(jīng)驗(yàn)證具有良好的抗原性和免疫原性。將其免疫小鼠后經(jīng)雜交瘤制備獲得抗豬HEV的三株單抗2C7,1E4和2G9。本研究通過原核表達(dá)sORF2-C截短蛋白、合成短肽等方法驗(yàn)證三株單抗在ORF2的結(jié)合位點(diǎn),利用模擬病毒的sp239蛋白吸附HepG 2細(xì)胞,以及作為HEV感染動物模型的兔子設(shè)計試驗(yàn),驗(yàn)證單抗在體外和體內(nèi)的抗病毒中和作用,以及單抗識別表位的免疫保護(hù)作用。本研究主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.抗豬HEV衣殼蛋白單抗識別抗原表位的鑒定原核表達(dá)sORF2-C截短蛋白后,用Western blotting與間接ELISA方法與單抗反應(yīng),找到其結(jié)合區(qū)域(4-7個氨基酸),進(jìn)一步合成短肽確定位于基因4型HEV衣殼蛋白上三株單抗2C7、2G9和1E4識別的表位分別為~(407)EPTV~(410),~(458)PSRPF~(462)和~(625)DFCP~(628)。1B5是經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期驗(yàn)證在豬、人、禽HEV上識別共有表位~(410)VLYTS~(411)的單抗�？臻g結(jié)構(gòu)預(yù)測驗(yàn)證了2C7、2G9和1B5識別的表位部分位于病毒表面,預(yù)示其可能具有抗病毒中和活性。同時,病毒捕獲試驗(yàn)結(jié)果顯示單抗2G9,1B5和2C7分別在400,400和200 ng/孔的包被濃度下可以捕獲到天然病毒;而1E4和小鼠陰性IgG均未捕獲到病毒。此外,序列分析比對發(fā)現(xiàn)2C7、2G9和1B5識別的三個表位在人、豬、兔及等其他動物源HEV中高度保守。2.抗豬HEV衣殼蛋白單抗抗病毒中和活性的鑒定有研究顯示原核表達(dá)基因1型HEV p239(368-606)蛋白可模擬病毒吸附HepG 2細(xì)胞。因此,本研究通過原核表達(dá)基因4型豬HEV ORF2對應(yīng)區(qū)域的截短蛋白,命名為sp239(aa 368-606),證明其在PB7.5溶液中組裝形成多聚體。經(jīng)IFA、Western blotting、FCM和RT-PCR驗(yàn)證,sp239可模擬病毒吸附并進(jìn)入HepG 2細(xì)胞,此外,2G9、2C7和1B5均可在體外部分阻斷sp239或病毒(利用低效病毒感染細(xì)胞系HepG 2)吸附HepG 2細(xì)胞;同時,本試驗(yàn)利用兔子作為HEV感染動物模型,將2G9、2C7和1B5(1E4與陽性血清作為陰、陽型對照組,同時設(shè)置正常組和僅攻毒組)與豬HEV糞便懸液孵育混合后接種兔子,檢測其糞便排毒、病毒血癥和抗體水平,發(fā)現(xiàn)單抗或陽性血清均能部分阻斷病毒感染兔子,或相較于攻毒組,出現(xiàn)糞便排毒延遲現(xiàn)象。以上結(jié)果說明,2G9、2C7和1B5具有中和豬HEV的活性,其識別的抗原表位可作為潛在的疫苗設(shè)計靶點(diǎn)。3.基因4型豬HEV中和表位免疫保護(hù)效果研究基因4型豬HEV ORF2衣殼蛋白的三株單抗2G9、2C7和1B5經(jīng)體內(nèi)驗(yàn)證具有中和病毒活性,提示其識別的表位可能產(chǎn)生抗HEV中和抗體。因此,本試驗(yàn)根據(jù)三株中和表位設(shè)計合成短肽:Pep EPTV(2G9)、Pep VKLYTS(1B5)、Pep PSRPF(2C7)、Pep EPTVKLYTS(2G9-1B5)和Pep EPTVKLYTSPSRPF(2G9-1B5-2C7);將以上短肽分別連接KLH及BSA用于免疫和檢測。合成后將短肽皮下免疫兔子,待抗體水平達(dá)到峰值并穩(wěn)定后耳緣靜脈攻毒豬HEV,攻毒后每周檢測糞便排毒、病毒血癥和抗體水平等指標(biāo)發(fā)現(xiàn):免疫短肽Pep EPTVKLYTSPSRPF或sp239后,兔子未出現(xiàn)HEV所引起的致病性反應(yīng),說明上述短肽對兔子感染基因4型豬HEV具有良好的保護(hù)效果;此外,免疫短肽Pep VKLYTS,Pep PSRPF,Pep EPTV和串聯(lián)表位短肽Pep EPTVKLYTS對兔子產(chǎn)生部分保護(hù)作用。綜上所述,本研究中抗基因4型豬HEV的三株單抗2G9,1B5和2C7經(jīng)體內(nèi)、外試驗(yàn)均驗(yàn)證其具有抗病毒中和活性;鑒定其識別HEV ORF2上的表位分別為~(407)EPTV~(410),~(410)VKLYTS~(411)和~(458)PSRPF~(462),據(jù)此合成短肽并設(shè)計動物試驗(yàn)驗(yàn)證其可在兔子體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性抗體,保護(hù)兔子免受基因4型豬HEV的感染。因此,以上試驗(yàn)結(jié)果為HEV疫苗設(shè)計提供靶點(diǎn)和理論依據(jù),對于HEV的防控有積極意義。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 1-1 HEV 基因組結(jié)構(gòu)（引自(Kamar et al. 2017)）Fig.1-1 HEV genome structure (cited from (Kamar et al. 2017))ORF1 編碼一個由 1700 個氨基酸組成的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括病毒 RNA 復(fù)制所需要的酶：甲基轉(zhuǎn)移酶（MeT），番木瓜蛋白樣蛋白酶（PCP），解旋酶（Hel）以及 RNA 依賴性 RNA 聚合酶（RdRp）(Koonin et al. 1992)。聚脯氨酸區(qū)域（PPR）是一段基因高變區(qū)，復(fù)制或插入的部分 ORF1 片段在此區(qū)域中被鑒定出(Johne et al. 2014; Lhomme et al2014; Shukla et al. 2011)。HEV 慢性感染免疫功能低下的患者后，PPR 區(qū)往往出現(xiàn)高度變異(Lhomme et al. 2014)。 基因 1 型 HEV 的 ORF1 包括一個額外的開放性閱讀框，即ORF4。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并與真核細(xì)胞伸長因子 1α1 互作后，激活病毒的聚合酶活性，由此產(chǎn)生了 ORF4 蛋白(Nair et al. 2016)。ORF2是660個氨基酸組成的病毒衣殼蛋白，因此也常用作HEV的檢測抗原。ORF2具有 3 個糖基化位點(diǎn)（Asn132，Asn310 和 Asn562）以及一個引導(dǎo)其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氨基酸末端信號肽(Zafrullah et al. 1999)。衣殼蛋白分為 3 個 domain，即 Shell，Middle 和Protruding domain。其中，Protruding domain 是中和抗體的主要靶區(qū)，包括預(yù)測受體結(jié)

圖 1-2 戊型肝炎病毒（HEV）復(fù)制，組裝和釋放的示意圖。（引自(Ju et al. 2019)）Fig.1-2 Schematic representation of hepatitis E virus (HEV) replication, assembly, and release. (citedfrom (Ju et al. 2019) )衣殼蛋白內(nèi)裝配病毒基因組被認(rèn)為是由 ORF2 與 HEV 基因組 RNA 的互作并進(jìn)調(diào)節(jié)后形成具有感染性的病毒顆粒的過程。ORF2進(jìn)化出一種可以區(qū)分病毒基因組RN和宿主 RNA 的機(jī)制，以確保病毒準(zhǔn)確無誤地組裝。ORF2 N’末端的信號肽可能通過HEV 基因組 5’末端的 76-nt（裝備信號）區(qū)域互作，參與病毒組裝過程中 RNA 基因的裝備(Surjit et al. 2004; Tam et al. 1991)。但這種互作需要更詳細(xì)的遺傳分析來確認(rèn)研究者推測HEV轉(zhuǎn)錄編碼ORF2和ORF3的RNA亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Graff et al. 2006)因此，RNA 衣殼裝配信號可能位于基因組的 5’末端，保證只有基因組全長的 RNA 能夠裝配在衣殼蛋白上。ORF2 寡聚化后形成二十面體衣殼，再裝配基因組 RNA，OR在接觸到衣殼化信號后繼續(xù)寡聚化（圖 1-2）。然而，RNA 介導(dǎo)的 ORF2 寡聚化以O(shè)RF2 負(fù)責(zé)寡聚化區(qū)域仍然未知。由于缺乏可用的高效培養(yǎng)細(xì)胞系，HEV 病毒粒子的組裝機(jī)制仍然不清楚。關(guān)于

第一章 文獻(xiàn)綜述EV 的病理生理學(xué)V 是一種非致病性病毒。急性感染 HEV 的結(jié)果是由宿主免疫應(yīng)答的vanel et al. 2016; Suneetha et al. 2012)。HEV 的發(fā)病包括三個不同階段：性感染期（從無癥狀演變?yōu)榧毙愿嗡ソ撸┖椭饾u恢復(fù)的康復(fù)期。雖然有自限性，但慢性感染會發(fā)生在免疫功能低下的個體。在免疫功能低 時，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答被抑制，導(dǎo)致豬體產(chǎn)生慢性肝炎并長期排毒

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本文編號：2828251