脂聯(lián)素(adiponectin,AdipoQ)作為一種新型的脂肪細(xì)胞因子,不僅在調(diào)控動物脂代謝方面具有一定影響,在調(diào)控動物生殖系統(tǒng)方面也具有一定的作用。目前,AdipoQ在人類、鼠、豬中被大量研究,且取得了可喜可賀的進(jìn)展。但在禽類中研究還不是很多,且關(guān)于AdipoQ對卵巢激素分泌功能的影響的報(bào)道甚少�；硌垸Z屬地方品種,以優(yōu)良的產(chǎn)蛋性能著稱于世。但近年來,由于雜交不規(guī)范,豁眼鵝的產(chǎn)蛋性能出現(xiàn)了退化趨勢。本試驗(yàn)通過構(gòu)建豁眼鵝AdipoQ基因原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化重組AdipoQ,用重組AdipoQ處理豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞,測定豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞分泌P_4和E_2的水平,檢測卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)生殖激素合成分泌相關(guān)因子StAR、CYP11A1和CYP19A1的基因和蛋白表達(dá)情況,探討AdipoQ在豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞激素分泌功能方面的可能作用,為進(jìn)一步研究AdipoQ對豁眼鵝生產(chǎn)性能的影響及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選取產(chǎn)蛋期(10月齡)豁眼鵝6只,分別采集其卵巢組織,根據(jù)GenBank中收錄的鴻雁AdipoQ基因序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行豁眼鵝AdipoQ基因CDS序列的擴(kuò)增,然后將純化后的AdipoQ目的片段與pMD18-T載體連接,構(gòu)建pMD18-T-AdipoQ重組質(zhì)粒。再用EcoRⅠ與XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,將目的片段與pET-28a載體連接,構(gòu)建pET-28a-AdipoQ重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并純化,最終獲得了含有His標(biāo)簽的重組AdipoQ。然后用純化后的重組AdipoQ(1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL)處理豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞,通過ELISA、qRT-PCR、免疫熒光和Western blot等方法檢測豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞中P_4和E_2分泌水平,以及生殖激素合成分泌相關(guān)因子StAR、CYP11A1、CYP19A1的mRNA與蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建pET-28a-AdipoQ重組表達(dá)載體后,利用其在0.4 mM IPTG、30℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h的條件下,成功獲得重組AdipoQ,并通過鎳柱親和層析的方法成功純化重組AdipoQ;重組AdipoQ處理豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞24 h后,可使卵泡顆粒細(xì)胞P_4分泌量極顯著升高(P0.01),E_2分泌量顯著降低(P0.05);StAR mRNA和蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P0.01),CYP11A1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05),CYP19A1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.05),其蛋白表達(dá)量雖有降低趨勢,但變化不明顯(P0.05);StAR蛋白和CYP11A1蛋白熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P0.05),CYP19A1蛋白熒光強(qiáng)度變化不顯著(P0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,重組AdipoQ對豁眼鵝卵泡顆粒細(xì)胞激素分泌功能具有一定影響,既可以通過上調(diào)StAR和CYP11A1的表達(dá),促進(jìn)P_4的合成與分泌,也可以通過下調(diào)CYP19A1的表達(dá),抑制E_2的合成與分泌,從而實(shí)現(xiàn)對卵巢分泌功能的調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S835
【部分圖文】：

圖 1-1 總 RNA 電泳圖1 The total RNA by Agarose gel electrop泳對卵巢組織提取的總 RNA 進(jìn)行帶明顯，表明提取的總 RNA 較純度，可用于下一步試驗(yàn)。 PCR 擴(kuò)增和膠回收R 擴(kuò)增結(jié)果

圖 1-1 總 RNA 電泳圖ig.1-1 The total RNA by Agarose gel electrophor電泳對卵巢組織提取的總 RNA 進(jìn)行檢s 條帶明顯，表明提取的總 RNA 較完整使用純度，可用于下一步試驗(yàn)。的 PCR 擴(kuò)增和膠回收 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖 1-3 膠回收電泳圖Fig.1-3 The gel extraction by Agarose gel electrophores注：M：15000DNAMarker；1,2：AdipoQ 基因片段Note：M：15000DNA Marker；1,2：AdipoQ gene segment看出，膠回收后的 AdipoQ 目的片段條帶清晰。段的克隆段陽性重組子菌落 PCR 鑒定結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2826650