IgG作為連接先天性免疫與獲得性免疫的功能分子,是抗原與受體及效應(yīng)分子相互作用的橋梁,其在血清中含量最高,同時(shí)半衰期最長,主要是由脾臟以及淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成。與抗原分子特異性結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物,改變Fc段的構(gòu)象,暴露相應(yīng)的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn),使得C1q與之結(jié)合,進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng);此外,IgG可通過其Fc片段特異性識(shí)別細(xì)胞表面的Fc受體,從而產(chǎn)生多種不同的生物學(xué)效應(yīng),主要包括:病毒中和作用、ADCC作用、胞外殺傷及免疫炎癥、吞噬調(diào)理作用等。IgG-Fc段作為抗體分子與細(xì)胞及效應(yīng)分子相互作用的重要結(jié)構(gòu)域,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),對(duì)抗體自身的抗原性起著決定性作用。IgG重鏈恒定區(qū)尤其是Fc段基因在不同動(dòng)物間相對(duì)保守,因此分析IgG重鏈Fc基因在不同動(dòng)物間的同源性,可以更加精確地反映不同動(dòng)物抗體間交叉免疫原性的差異。本試驗(yàn)選用貉IgG重鏈為研究對(duì)象,研究內(nèi)容主要分為三部分:第一部分貉IgG重鏈基因序列測定及分析根據(jù)NCBI上已公布的犬、水貂IgG重鏈基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,從病貉的脾臟內(nèi)提取RNA。通過Race技術(shù)首次成功克隆貉IgG重鏈全基因,序列全長1474bp,編碼491個(gè)氨基酸。利用多種軟件對(duì)其IgG重鏈基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和遺傳進(jìn)化分析。核苷酸分析結(jié)果顯示貉與犬IgG間親緣關(guān)系最近,同源性為92.6%,與貓的同源性為83.0%,與水貂的同源性為82.8%,與人的同源性為75.9%,與鼠的同源性為68.2%。氨基酸序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),貉與犬同源性為89.6%,與水貂的同源性為77.2%,與人的同源性70%左右,與鼠在60%左右。通過Swiss-model同源建模,對(duì)貉、犬IgG三維晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,得出貉、犬IgG三維結(jié)構(gòu)均基于人類IgG分子建模,立體結(jié)構(gòu)的相似度保持在70%左右。關(guān)鍵氨基酸差別和三維空間結(jié)構(gòu)的不同是IgG的遺傳變異所在。第二部分不同種屬動(dòng)物間IgG免疫原交叉性分析不同種屬動(dòng)物的IgG三維立體結(jié)構(gòu)具有較高的相似性,同時(shí)其各自Fc段氨基酸殘基相對(duì)保守,預(yù)示了不同動(dòng)物IgG與不同動(dòng)物的酶標(biāo)二抗間存在交叉反應(yīng),但其交叉反應(yīng)強(qiáng)度與IgG-Fc段的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。通過dot-ELISA及WesternBlot試驗(yàn),檢測了小鼠、雞、鴨、人、貉、兔、水貂血清抗體分別與抗犬、抗兔、抗鼠和抗人四種酶標(biāo)二抗間的交叉反應(yīng)性,同時(shí)分析了貉IgG-Fc融合蛋白與抗犬二抗間的免疫原交叉性。結(jié)果表明,不同動(dòng)物的IgG之間,或多或少都存在一些交叉性。不同綱目之間的動(dòng)物也可有一定程度的交叉免疫反應(yīng),例如雞與犬二抗間有相對(duì)明顯的交叉反應(yīng),而與兔、鼠、人二抗間幾乎不存在免疫交叉。第三部分貉IgG-Fc多肽生物功能活性分析借助文獻(xiàn)及在線軟件分析貉Fc區(qū)功能活性位點(diǎn),人工合成貉IgG-Fc區(qū)多肽NTVSITCLVK(N10K)、PSVYVLPPSQ(P10Q)及陰性對(duì)照多肽MSTAVSKCAT(NC),Fc多肽在不同濃度下與小鼠外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)18h檢測上清液中細(xì)胞因子含量(TNF-α,IL-1β,IL-6),發(fā)現(xiàn)在濃度為10μg/m L時(shí),多肽N10K可以刺激淋巴細(xì)胞分泌更多的TNF-α(271.95pg/m L),IL-1β(27.42pg/m L),而多肽P10Q可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較多的IL-6(35.51pg/m L)。初步確定貉IgGFc區(qū)多肽P10Q及N10K對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的體外免疫誘導(dǎo)功能活性,同時(shí)為今后貉源疾病預(yù)防及治療奠定基礎(chǔ),為研究多肽疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S858.92
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文發(fā)揮重要作用（Radaevand Sun, 2001a; Radaevson S L, 2004），CH3（或 CH4）能與細(xì)胞表面調(diào)理吞噬及超敏反應(yīng)（Bennett J C et al., 1965）G Fc 片段為馬蹄形雙重對(duì)稱的二聚體晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)與 Fc 段基本相同，因絞鏈區(qū)的存在，F(xiàn)ab 與得 IgG 呈現(xiàn)不對(duì)稱性和良好的靈活性。 region）是位于 CH1 和 CH2 之間的 10 到 60 個(gè)片段，因其含有大量脯氨基酸殘基（Dall’鍵，阻礙螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，所以有利于免疫球蛋分子不同位置上的表位結(jié)合，從而利于補(bǔ)體結(jié)感，經(jīng)蛋白酶處理的 Ig 多在該區(qū)裂解。

圖 2 Fc 片段各種效應(yīng)功能Fig 2 Fc fragments of various effector functions體系統(tǒng)抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后，可因 Fc 片段構(gòu)象區(qū)內(nèi)的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)暴露，C1q 的頭部可以直接結(jié)合IgG結(jié)合在CH2區(qū)，從而通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)（Sa激活后，可以通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解；還可通段發(fā)揮趨化、促炎等效應(yīng)。蛋白 Fc 受體生物學(xué)特性94 年，第一只 IgG Fc 受體（ FcR） 基因敲出小鼠研究體內(nèi)的生物學(xué)功能活性研究取得了巨大進(jìn)步。作為 IgG，F(xiàn)c 受體在許多效應(yīng)細(xì)胞以及免疫輔助細(xì)胞表面表達(dá)胞免疫的橋梁，在免疫細(xì)胞和抗原抗體復(fù)合物以及其他

I （CD32）為 40 kDa 左右的跨膜糖蛋白，含有 2 個(gè) Ig 樣低親和力受體,在生理?xiàng)l件下不能結(jié)合IgG單體,只能與IgG作為細(xì)胞分布最廣泛的 Fc 受體，主要存在于單核細(xì)胞、胞、嗜中 性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、血小板、B 細(xì)胞、D（Berntzen G.et al., 2009; Flesch et al., 2000），研究發(fā)現(xiàn)其基質(zhì)細(xì)胞中也存在表達(dá)。RIII（CD16）II（CD16）為 50-80 kDa 的膜糖蛋白，含有 2 個(gè) Ig 樣胞外 中低親和力受體（Raghavan et al., 1996）。作為自然殺傷 受體，在肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒單核細(xì)胞分化的腹腔巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)，但是在達(dá)，（Nishio M et al., 2009; Flesch et al., 2000）。

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本文編號(hào)：2826837