IgG作為連接先天性免疫與獲得性免疫的功能分子,是抗原與受體及效應分子相互作用的橋梁,其在血清中含量最高,同時半衰期最長,主要是由脾臟以及淋巴結(jié)中的漿細胞合成。與抗原分子特異性結(jié)合形成抗原-抗體復合物,改變Fc段的構(gòu)象,暴露相應的補體結(jié)合位點,使得C1q與之結(jié)合,進而激活補體系統(tǒng);此外,IgG可通過其Fc片段特異性識別細胞表面的Fc受體,從而產(chǎn)生多種不同的生物學效應,主要包括:病毒中和作用、ADCC作用、胞外殺傷及免疫炎癥、吞噬調(diào)理作用等。IgG-Fc段作為抗體分子與細胞及效應分子相互作用的重要結(jié)構(gòu)域,介導細胞免疫應答反應,對抗體自身的抗原性起著決定性作用。IgG重鏈恒定區(qū)尤其是Fc段基因在不同動物間相對保守,因此分析IgG重鏈Fc基因在不同動物間的同源性,可以更加精確地反映不同動物抗體間交叉免疫原性的差異。本試驗選用貉IgG重鏈為研究對象,研究內(nèi)容主要分為三部分:第一部分貉IgG重鏈基因序列測定及分析根據(jù)NCBI上已公布的犬、水貂IgG重鏈基因的保守區(qū)域設(shè)計引物,從病貉的脾臟內(nèi)提取RNA。通過Race技術(shù)首次成功克隆貉IgG重鏈全基因,序列全長1474bp,編碼491個氨基酸。利用多種軟件對其IgG重鏈基因進行生物信息學分析和遺傳進化分析。核苷酸分析結(jié)果顯示貉與犬IgG間親緣關(guān)系最近,同源性為92.6%,與貓的同源性為83.0%,與水貂的同源性為82.8%,與人的同源性為75.9%,與鼠的同源性為68.2%。氨基酸序列進行比較分析發(fā)現(xiàn),貉與犬同源性為89.6%,與水貂的同源性為77.2%,與人的同源性70%左右,與鼠在60%左右。通過Swiss-model同源建模,對貉、犬IgG三維晶體結(jié)構(gòu)進行預測,得出貉、犬IgG三維結(jié)構(gòu)均基于人類IgG分子建模,立體結(jié)構(gòu)的相似度保持在70%左右。關(guān)鍵氨基酸差別和三維空間結(jié)構(gòu)的不同是IgG的遺傳變異所在。第二部分不同種屬動物間IgG免疫原交叉性分析不同種屬動物的IgG三維立體結(jié)構(gòu)具有較高的相似性,同時其各自Fc段氨基酸殘基相對保守,預示了不同動物IgG與不同動物的酶標二抗間存在交叉反應,但其交叉反應強度與IgG-Fc段的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。通過dot-ELISA及WesternBlot試驗,檢測了小鼠、雞、鴨、人、貉、兔、水貂血清抗體分別與抗犬、抗兔、抗鼠和抗人四種酶標二抗間的交叉反應性,同時分析了貉IgG-Fc融合蛋白與抗犬二抗間的免疫原交叉性。結(jié)果表明,不同動物的IgG之間,或多或少都存在一些交叉性。不同綱目之間的動物也可有一定程度的交叉免疫反應,例如雞與犬二抗間有相對明顯的交叉反應,而與兔、鼠、人二抗間幾乎不存在免疫交叉。第三部分貉IgG-Fc多肽生物功能活性分析借助文獻及在線軟件分析貉Fc區(qū)功能活性位點,人工合成貉IgG-Fc區(qū)多肽NTVSITCLVK(N10K)、PSVYVLPPSQ(P10Q)及陰性對照多肽MSTAVSKCAT(NC),Fc多肽在不同濃度下與小鼠外周血淋巴細胞共培養(yǎng)18h檢測上清液中細胞因子含量(TNF-α,IL-1β,IL-6),發(fā)現(xiàn)在濃度為10μg/m L時,多肽N10K可以刺激淋巴細胞分泌更多的TNF-α(271.95pg/m L),IL-1β(27.42pg/m L),而多肽P10Q可以促進淋巴細胞產(chǎn)生較多的IL-6(35.51pg/m L)。初步確定貉IgGFc區(qū)多肽P10Q及N10K對外周血淋巴細胞的體外免疫誘導功能活性,同時為今后貉源疾病預防及治療奠定基礎(chǔ),為研究多肽疫苗提供了實驗依據(jù)。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S858.92
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文發(fā)揮重要作用（Radaevand Sun, 2001a; Radaevson S L, 2004），CH3（或 CH4）能與細胞表面調(diào)理吞噬及超敏反應（Bennett J C et al., 1965）G Fc 片段為馬蹄形雙重對稱的二聚體晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)與 Fc 段基本相同，因絞鏈區(qū)的存在，F(xiàn)ab 與得 IgG 呈現(xiàn)不對稱性和良好的靈活性。 region）是位于 CH1 和 CH2 之間的 10 到 60 個片段，因其含有大量脯氨基酸殘基（Dall’鍵，阻礙螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，所以有利于免疫球蛋分子不同位置上的表位結(jié)合，從而利于補體結(jié)感，經(jīng)蛋白酶處理的 Ig 多在該區(qū)裂解。

圖 2 Fc 片段各種效應功能Fig 2 Fc fragments of various effector functions體系統(tǒng)抗原結(jié)合形成抗原-抗體復合物后，可因 Fc 片段構(gòu)象區(qū)內(nèi)的補體結(jié)合位點暴露，C1q 的頭部可以直接結(jié)合IgG結(jié)合在CH2區(qū)，從而通過經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)（Sa激活后，可以通過級聯(lián)反應導致靶細胞溶解；還可通段發(fā)揮趨化、促炎等效應。蛋白 Fc 受體生物學特性94 年，第一只 IgG Fc 受體（ FcR） 基因敲出小鼠研究體內(nèi)的生物學功能活性研究取得了巨大進步。作為 IgG，F(xiàn)c 受體在許多效應細胞以及免疫輔助細胞表面表達胞免疫的橋梁，在免疫細胞和抗原抗體復合物以及其他

I （CD32）為 40 kDa 左右的跨膜糖蛋白，含有 2 個 Ig 樣低親和力受體,在生理條件下不能結(jié)合IgG單體,只能與IgG作為細胞分布最廣泛的 Fc 受體，主要存在于單核細胞、胞、嗜中 性粒細胞、嗜堿性粒細胞、血小板、B 細胞、D（Berntzen G.et al., 2009; Flesch et al., 2000），研究發(fā)現(xiàn)其基質(zhì)細胞中也存在表達。RIII（CD16）II（CD16）為 50-80 kDa 的膜糖蛋白，含有 2 個 Ig 樣胞外 中低親和力受體（Raghavan et al., 1996）。作為自然殺傷 受體，在肥大細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒單核細胞分化的腹腔巨噬細胞和巨噬細胞中表達，但是在達，（Nishio M et al., 2009; Flesch et al., 2000）。

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本文編號：2826837