發(fā)布時間：2017-04-02 13:15

  本文關(guān)鍵詞：PCV2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：利用細(xì)菌發(fā)酵和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)所涉及的高成本使從轉(zhuǎn)基因動物乳汁和尿液生成和回收重組蛋白具有巨大的吸引力和競爭力。乳腺生物反應(yīng)器所獲得的產(chǎn)物具有蛋白活性高、蛋白產(chǎn)量高,生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn),是一種具有巨大潛力的生物技術(shù),為制備商業(yè)化藥用蛋白和疫苗提供了廣闊的前景。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原,每年給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,PCV2抗原抗體及疫苗的研究越來越多,這為臨床上有效預(yù)防豬的PCV2感染提供了堅實(shí)的保障。本論文構(gòu)建了豬圓環(huán)病毒2型PCV2的真核表達(dá)載體后轉(zhuǎn)染山羊成纖維細(xì)胞,建立陽性細(xì)胞克隆,為采用體細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)PCV2基因奶山羊乳腺生物反應(yīng)器的制作提供生物材料。首先通過RT-PCR擴(kuò)增目的基因PCV2,將其連接到真核載體PCDNA3.1,構(gòu)建重組載體PCDNA3.1-PCV2,采用PCR及雙酶切方法對其進(jìn)行鑒定,驗(yàn)證所構(gòu)建的真核表達(dá)載體;其次通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,將PCDNA3.1-PCV2對奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,利用real time-PCR及Western blotting檢測,驗(yàn)證真核表達(dá)載體能否正確表達(dá)目的蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)雙酶切及測序證實(shí),pcDNA 3.1-PCV2酶切片段的長度與預(yù)期大小相符。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染和G418篩選,成功的將pcDNA 3.1-PCV2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到了奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,得到了陽性細(xì)胞系。經(jīng)RT-PCR和Western Blot檢測,PCV2在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中表達(dá)成功。本論文為制作奶山羊乳腺生物反應(yīng)器進(jìn)行PCV2蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬圓環(huán)病毒2型 PCV2 pcDNA 3.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要5-6
• Summary6-7
• 縮略詞(Abbreviations)7-9
• 第一章：文獻(xiàn)綜述：生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白研究進(jìn)展9-19
• 1. 引言9-10
• 2. 乳腺生物反應(yīng)器10-14
• 3. 豬圓環(huán)病毒PCV-2 研究進(jìn)展14-18
• 4．本研究目的及意義18-19
• 第二章 試驗(yàn)部分19-47
• 試驗(yàn)一PCV2真核表達(dá)載體的構(gòu)建19-29
• 1．試驗(yàn)材料19-20
• 2、試驗(yàn)方法20-25
• 3. 結(jié)果與分析25-27
• 4．討論27-29
• 試驗(yàn)二 重組質(zhì)粒pcDNA 3.1-PCV2在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染及篩選29-40
• 1．試驗(yàn)材料29-30
• 2、試驗(yàn)方法30-35
• 3. 結(jié)果與分析35-38
• 4．討論38-40
• 試驗(yàn)三 陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的檢測與鑒定40-47
• 1．試驗(yàn)材料40-41
• 2．試驗(yàn)方法41-44
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果與分析44-46
• 4. 討論46-47
• 第三章 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 致謝52-53
• 個人簡介53-54
• 導(dǎo)師簡介54

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  本文關(guān)鍵詞：PCV2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：282571