Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為機體的一種模式識別分子,通過識別入侵病原體的特定結(jié)構(gòu)啟動先天免疫,同時也與獲得性免疫相關(guān)聯(lián),在機體發(fā)揮抵抗病原微生物感染的作用。不同TLRs識別病原體的種類不同,其中TLR2識別配體范圍較廣。鴨TLR2的研究一直是禽類研究的熱點。本研究對綠頭鴨TLR2胞外區(qū)片段進行克隆和原核表達,制備多克隆抗體,對禽流感疫苗免疫后綠頭鴨組織中TLR2的表達量和組織定位進行分析,獲得的結(jié)果如下:首先根據(jù)已發(fā)表的北京鴨TLR2基因胞外區(qū)序列,設(shè)計一對特異性引物,以綠頭鴨脾組織為材料獲得總RNA,通過RT-PCR擴增綠頭鴨TLR2胞外區(qū),得到片段長度為1788 bp,將其與pEASY-T1克隆載體連接,獲得陽性重組克隆質(zhì)粒經(jīng)測序后,與北京鴨TLR2核苷酸序列一致,獲得了綠頭鴨TLR2胞外區(qū)序列;將胞外區(qū)與pET-32a原核表達載體連接,構(gòu)建重組原核表達載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE電泳檢測,在110 KDa處,出現(xiàn)特異的重組蛋白。將重組蛋白與弗氏完全佐劑混合后制備免疫原,對家兔進行免疫,獲得兔抗鴨TLR2胞外區(qū)多克隆抗體。進行Western blot檢測獲得一條110 KDa雜交帶,表明該蛋白為鴨TLR2胞外區(qū)基因表達產(chǎn)物。采用半定量PCR技術(shù)檢測實驗組(禽流感疫苗免疫)和對照組中心臟、肝臟、脾臟、肺臟和胸腺組織中的TLR2 mRNA表達水平,實驗組鴨TLR2均高于對照組,并且TLR2在脾臟中均高度表達,在胸腺、肝臟、肺臟中適中表達,在心臟中低度表達。實驗組鴨IFN-αmRNA均高于對照組,并且脾臟中的IFN-α也高度表達,在胸腺、肝臟中適中表達,在心臟和肺臟中低度表達。表明禽流感疫苗免疫后的5種組織中TLR2及IFN-α表達量升高,且脾臟是產(chǎn)生TLR2的主要部位。采用免疫組化技術(shù)檢測出脾臟、心臟、肝臟中均有TLR2的表達,而且實驗組中鴨TLR2的表達量均高于對照組,通過Image pro軟件分析脾臟是產(chǎn)生TLR2的主要部位,且主要分布在細胞質(zhì)、細胞膜中。上述結(jié)果表明禽流感疫苗免疫后綠頭鴨TLR2和IFN-α表達量均升高,其在抗原入侵機體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的抗感染作用,該因子的分析為后續(xù)其功能的深入研究奠定了基礎(chǔ),同時也為鴨相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.52
【部分圖文】：

2-1 脾組織中總 RNA 的提xtraction of total RNA from sp因的克隆的擴增材料，提取的總 RNA 為模A 序列設(shè)計一對特異性引帶，如圖 2-2 所示，目的法擴增，可獲得目的基因M 1 2

圖 2-1 脾組織中總 RNA 的提Extraction of total RNA from sp因的克隆的擴增材料，提取的總 RNA 為模A 序列設(shè)計一對特異性引帶，如圖 2-2 所示，目的 法擴增，可獲得目的基因M 1 2

圖 2-3 duTLR2 胞外區(qū)序列-3 : Glue recyclingof duTLR2 e子量標準 2000； 1，2：目的maker 2000; 1,2:Target gene;3:的鑒定化大腸桿菌 DH5α中，經(jīng)進行 PCR 擴增，經(jīng) 0.8％瓊800 bp，與預(yù)期條帶大小相如圖 2-4 所示。0 bp0 bpM 1 2 3 4

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本文編號：2823492