柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)是7種雞艾美耳球蟲中的一員,具有很強(qiáng)的致病力。E.tenella屬于嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)專性寄生蟲,有著復(fù)雜的生活史,必須依靠宿主細(xì)胞才能完成其生活周期。阻止蟲體入侵細(xì)胞和在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育可能是預(yù)防和控制球蟲病的有效方法。因此,鑒定與蟲體入侵相關(guān)的關(guān)鍵分子對(duì)于開發(fā)新的抗球蟲藥物和疫苗具有重大作用。目前,對(duì)艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的研究主要集中在蟲體蛋白上,而與艾美耳球蟲相關(guān)的宿主蛋白鮮有報(bào)道。本研究首次采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)來篩選感染與未感染E.tenella子孢子72h的雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞中差異表達(dá)蛋白,并研究了其中的三個(gè)差異表達(dá)蛋白—脂肪酸結(jié)合蛋白4(proteins fatty acid binding protein 4,FABP4)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、原鈣黏蛋白10(protocadherin 10,PCDH10)對(duì)E.tenella入侵細(xì)胞的影響,研究結(jié)果為闡明球蟲與宿主相互作用的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。1.基于iTRAQ技術(shù)分析柔嫩艾美耳球蟲感染后CEF細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白E.tenella是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)專性寄生蟲,當(dāng)受到E.tenella感染時(shí),宿主細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列變化以應(yīng)對(duì)蟲體感染。但目前,關(guān)于宿主細(xì)胞應(yīng)對(duì)球蟲感染機(jī)制的研究極其有限。本研究通過iTRAQ與LC-MS/MS聯(lián)合技術(shù)分析了感染E.tenella子孢子72h后CEF細(xì)胞的蛋白質(zhì)組表達(dá)變化,共鑒定出3967個(gè)非冗余蛋白質(zhì),與不感染組相比,感染組有259個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量發(fā)生了明顯變化,其中上調(diào)蛋白質(zhì)145個(gè),下調(diào)蛋白質(zhì)114個(gè)。GO分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些差異表達(dá)蛋白主要具有結(jié)合活性、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)子活性等分子功能。KEGG通路分析表明這些差異表達(dá)蛋白主要參與了細(xì)胞外基質(zhì)受體互作、糖酵解/糖異生、粘著斑、氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路。利用q-PCR對(duì)蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,q-PCR結(jié)果顯示7個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化與iTRAQ結(jié)果一致,而1個(gè)基因的不一致。研究結(jié)果為探索寄生蟲與宿主相互作用的機(jī)制提供了新的視角。2.FABP4對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵細(xì)胞的影響成功克隆了雞FABP4基因(458-bp),并連接至pET-28c(+)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28c(+)-FABP4,誘導(dǎo)表達(dá)了大小為18.5kDa的重組蛋白,經(jīng)Western blotting驗(yàn)證后確定了所獲得的重組蛋白為FABP4。Western blotting和免疫組織化學(xué)結(jié)果均顯示,FABP4在E.tenella子孢子感染細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。而q-PCR結(jié)果顯示,在E.tenella子孢子感染的DF-1細(xì)胞中FABP4的表達(dá)量上升。我們推測(cè)產(chǎn)生mRNA水平與蛋白水平不一致的現(xiàn)象,是由于存在轉(zhuǎn)錄后修飾或蛋白質(zhì)降解等情況�？贵w抑制實(shí)驗(yàn)表明,50、100、200、300和400μg/mL的抗FABP4抗體對(duì)子孢子入侵無明顯影響。分別使用BMS-309403和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(TGF-β3)抑制和促進(jìn)DF-1細(xì)胞中表達(dá)FABP4后,檢測(cè)它們對(duì)子孢子入侵細(xì)胞的影響。BMS-309403處理組的入侵率未受到顯著影響,而TGF-β3處理組的入侵率顯著下降。結(jié)果表明宿主FABP4在E.tenella入侵中起負(fù)調(diào)控作用。3.GAPDH對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵細(xì)胞的影響成功克隆了雞GAPDH基因(1123-bp),并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GAPDH,表達(dá)了大小為61.7 kDa的GAPDH重組蛋白。q-PCR和免疫組織化學(xué)均顯示,GAPDH在E.tenella子孢子感染的細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高。Western blotting結(jié)果顯示,在E.tenella子孢子感染的細(xì)胞中GAPDH的表達(dá)量與未感染細(xì)胞無明顯差異�？贵w抑制實(shí)驗(yàn)表明,與相同濃度正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg/mL的抗GAPDH抗體均能明顯抑制子孢子的入侵。結(jié)果表明宿主GAPDH在E.tenella入侵中起正調(diào)控作用。4.PCDH10對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵細(xì)胞的影響成功克隆了PCDH10基因(1631-bp),并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pColdⅠ-PCDH10,表達(dá)了大小為63.2 kDa的PCDH10重組蛋白。Western blotting和免疫組織化學(xué)均顯示,PCDH10在E.tenella子孢子感染的細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低�？贵w抑制實(shí)驗(yàn)表明,50、100、200、300和400μg/mL的抗PCDH10抗體對(duì)子孢子入侵無明顯影響。需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)PCDH10在E.tenella感染宿主細(xì)胞過程中的作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

學(xué)位論文 第二章 基于 iTRAQ 技術(shù)分析柔嫩艾美耳球蟲感染后 CE 電泳泳結(jié)果顯示(圖 2.1)，6 個(gè)蛋白樣品均條帶清晰，且平行性較并且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間有明顯的不同的條帶模式，即實(shí)驗(yàn)組樣品可用于后續(xù)分析。primer sequences (5' 3')p-AGCAGGCTTCCAGTTCATGTCTTC, lp-AAGATCACAGTCCTTGGp-GTCAATCCAGGCTGAAGATGAGAGTG, lp-GTTCCACCATCATACp-GCTGCGAGTGGATCAGGTGTAAC, lp-CGTAGTATTGGAAGGCTG

術(shù)分析柔嫩艾美耳球蟲感染后 CEF 細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白14圖2.2 鑒定蛋白的分子量和覆蓋率分布Fig2.2 Molecular weight and distribution of coverage ratio about identificated protein2.3.2.2 鑒定肽段長(zhǎng)度分布如圖 2.3 所示，鑒定到的肽段所含氨基酸數(shù)目主要在 5~30 之間。圖2.3 肽段長(zhǎng)度分布Fig2.3 Peptide length distribution2.3.2.3 定量比值直方分布分析對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)分布直方圖分析，各組標(biāo)簽比參考標(biāo)簽后取 Log2 對(duì)數(shù)，見圖 2.4。

2.3.2.2 鑒定肽段長(zhǎng)度分布如圖 2.3 所示，鑒定到的肽段所含氨基酸數(shù)目主要在 5~30 之間。圖2.3 肽段長(zhǎng)度分布Fig2.3 Peptide length distribution2.3.2.3 定量比值直方分布分析對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)分布直方圖分析，各組標(biāo)簽比參考標(biāo)簽后取 Log2 對(duì)數(shù)，見圖 2.4。

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