乳蛋白和乳脂肪是在哺乳動物的乳腺上皮細(xì)胞中被合成的,其合成的過程及調(diào)控是非常重要的代謝過程。乳蛋白和乳脂的合成機理是很重要的生命科學(xué)問題,近年來,越來越多的研究去揭示乳蛋白及乳脂肪合成的機理,但是研究進(jìn)展卻很少�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路主要調(diào)控乳蛋白的生成,而SREBP-1c促進(jìn)脂類合成,但氨基酸和激素如何調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c尚不很清楚。有研究表明,m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase-like protein 3,METTL3)可以通過調(diào)控mRNA中m6A甲基化水平,進(jìn)而對細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成起到重要的調(diào)節(jié)作用,但其是否能夠調(diào)節(jié)乳腺中乳蛋白和乳脂肪的合成尚未見報道。本試驗首次研究METTL3在牛乳腺細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中對乳蛋白和乳脂肪的調(diào)節(jié)作用及其分子機理。本實驗中,采用了組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)并純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞,用蛋白質(zhì)免疫印記(Western blotting)和免疫熒光(Imunofluorescience,IF)檢測細(xì)胞中角蛋白18(CK18)和CSN2的表達(dá)以鑒定細(xì)胞的純度和泌乳功能。應(yīng)用Western blotting檢測METTL3超表達(dá)和抑制時METTL3對BMECs中乳蛋白和乳脂的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)過表達(dá)METTL3時,mTOR、Gly RS、CSN2、SREBP-1c等表達(dá)量均增加p-mTOR、p-Gly RS的表達(dá)水平也有明顯的升高;當(dāng)抑制METTL3時,mTOR、Gly RS、CSN2、SREBP-1c等表達(dá)量均減少,p-mTOR、p-Gly RS的表達(dá)水平也有明顯的降低。表明METTL3可以通過調(diào)控乳脂、乳蛋白的相關(guān)信號通路分子的基因表達(dá)進(jìn)而影響乳脂、乳蛋白的合成。實驗通過建立β-雌激素(E)和蛋氨酸(Met)刺激的BMECs模型,利用IF法檢測添加E和Met時METTL3定位和表達(dá)變化。結(jié)果顯示,METTL3主要分布在核內(nèi),添加E和Met可以上調(diào)METTL3的表達(dá),增加METTL3的核定位。本實驗選用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)沉淀并鑒定了細(xì)胞中METTL3的相互作用蛋白GlyRS。結(jié)果顯示,METTL3與Gly RS在胞核中結(jié)合。添加Met或E后利用siRNA對Gly RS進(jìn)行干擾,應(yīng)用Western blotting檢測mTOR、CSN2、SREBP-1c、Gly RS、和METTL3的表達(dá)量以及p-mTOR、p-Gly RS表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示,Gly RS干擾后,阻斷了Met和E對CSN2、SREBP-1c、p-mTOR的蛋白水平的促進(jìn)作用。對Gly RS進(jìn)行過表達(dá)同時利用si RNA干擾METTL3,Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Gly RS后mTOR、CSN2、SREBP-1c、Gly RS和METTL3的表達(dá)量明顯升高,但同時干擾METTL3后Gly RS對mTOR、CSN2、SREBP-1c、Gly RS和METTL3的表達(dá)的促進(jìn)作用仍然存在但明顯降低,p-mTOR、p-Gly RS的表達(dá)水平也有明顯的降低。這說明,Gly RS介導(dǎo)Met或E信號部分通過調(diào)節(jié)METTL3從而調(diào)節(jié)mTOR和SREBP-1c基因表達(dá)控制乳脂肪和乳蛋白的合成。綜上所述,METTL3作為一個重要的信號分子,可以正向調(diào)節(jié)BMECs的合成。當(dāng)Gly RS接受Met或E的刺激后,可以促進(jìn)METTL3的表達(dá),通過上調(diào)mTOR、SREBP-1c以及Gly RS的表達(dá)量,提高p-mTOR、p-Gly RS的表達(dá)水平以促進(jìn)乳蛋白和乳脂肪的合成。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S823
【部分圖文】：

3 結(jié)果與分析3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定3.1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與純化經(jīng)過組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞，利用細(xì)胞對胰蛋白酶的敏感度不同純細(xì)胞。每兩天換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，以供應(yīng)細(xì)胞生長正常的營養(yǎng)。當(dāng)瓶內(nèi)鋪好小組織塊培養(yǎng)每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，如圖 3-1 A，當(dāng)培養(yǎng)至大約 7 d 時，開始有成纖維細(xì)胞長出，大約 15 d 時，瓶內(nèi)開始生長出乳腺上皮細(xì)胞，出現(xiàn)了乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合的（圖 3-1 B），當(dāng)細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶底的時候，輕輕吹掉組織塊，加入胰酶，利用成纖維細(xì)胰酶的敏感性使成纖維細(xì)胞懸浮，加入培養(yǎng)液終止消化并倒掉，經(jīng)過多次純化后得到純腺上皮細(xì)胞（圖 3-1 C），純化后的細(xì)胞長滿以后，為了能讓細(xì)胞更好的生長，要對細(xì)胞傳代培養(yǎng)。顯微鏡下可以看到純化后的乳腺上皮細(xì)胞呈橢圓形，長的飽滿、密集；而成細(xì)胞呈長梭型，長的分散（圖 3-1 D）。

注：FITC 標(biāo)記 CK18 為紅色；DAPI 染細(xì)胞核為藍(lán)色。圖 3-2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的 CK18 免疫熒光鑒定（×800）。2 Identification of bovine mammary epithelial cell by immunofluorescence o(×800). 蛋白質(zhì)免疫印跡法鑒定 BMECs WB 檢測細(xì)胞中 CK18 與 CSN2 的表達(dá)。結(jié)果如圖 3-3。結(jié)果顯示，在 BM2 均有表達(dá)，而成纖維細(xì)胞沒有，說明成功培養(yǎng)出了具有泌乳功能的奶牛 Western blotting 檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞（BMECs）中 CK18 和 CSN2 的3 Detection of expression of CK18 and CSN2 in dairy cow mammary gland ecell with Western blotting.

C 標(biāo)記 CK18 為紅色；DAPI 染細(xì)胞核腺上皮細(xì)胞的 CK18 免疫熒光鑒vine mammary epithelial cell by im(×800).法鑒定 BMECs18 與 CSN2 的表達(dá)。結(jié)果如圖 3-維細(xì)胞沒有，說明成功培養(yǎng)出了

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 生冉;閆素梅;;催乳素與其他激素對乳腺內(nèi)乳成分合成的協(xié)同調(diào)節(jié)作用[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2014年06期

2 陳洪菊;屈藝;母得志;;mTOR信號通路的生物學(xué)功能[J];生命的化學(xué);2010年04期

3 徐元年;張幸開;袁耀明;鄭建國;張連軍;;過瘤胃賴氨酸和過瘤胃蛋氨酸對泌乳早期奶牛生產(chǎn)性能影響的研究[J];乳業(yè)科學(xué)與技術(shù);2007年01期

本文編號：2823199