豬促卵泡素(pFSH)是由豬垂體前葉合成分泌的糖蛋白促性腺激素,由α和β亞基組成。FSH在雌性和雄性動物性腺發(fā)育中起著決定性作用,是卵泡發(fā)育和成熟的關(guān)鍵。在家畜繁殖管理中,pFSH主要應(yīng)用于誘導(dǎo)卵泡發(fā)育。由于生產(chǎn)效率低、半衰期短、活性不穩(wěn)定等原因,pFSH在家畜繁殖管理中的應(yīng)用受到限制。畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)具有產(chǎn)量高,純化方式簡單等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于重組蛋白的工業(yè)生產(chǎn)。但是pFSH在畢赤酵母的重組表達(dá)卻始終面臨著效率低的瓶頸,仍難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。本研究旨在利用一系列分子策略,并通過優(yōu)化發(fā)酵條件,提高pFSH在畢赤酵母中的分泌和表達(dá)效率。在分子策略方面,本實(shí)驗(yàn)分別探討了菌株篩選、密碼子優(yōu)化、融合蛋白表達(dá)等對pFSH重組效率的影響。結(jié)果表明,與Muts表型菌株KM71(在甲醇培養(yǎng)液中生長緩慢)相比,pFSH在Mut+表型菌株GS115(在甲醇培養(yǎng)液中快速生長)中的表達(dá)量能夠提高96%,提示GS115更適合pFSH的表達(dá)。接下來,本實(shí)驗(yàn)以pFSH的主要活性亞基pFSHβ為模板,探討密碼子優(yōu)化和融合標(biāo)簽對pFSH重組蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明,通過調(diào)整密碼子識別效率、RNA二級結(jié)構(gòu)及mRNA自由能,pFSHβ蛋白表達(dá)水平分別提高143%和22%,并初步確認(rèn)密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)大于0.8和G+C含量大于40%的條件下,pFSHβ表達(dá)效率更高。為了進(jìn)一步提高融合蛋白的產(chǎn)量,本實(shí)驗(yàn)比較了不同融合標(biāo)簽、融合方向和融合蛋白間的連接序列對pFSHβ表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示,融合蛋白HSA-pFSHβ在畢赤酵母中的產(chǎn)量明顯地高于蛋白pFSHβ或SUMO-pFSHβ。另外,改變HSA與pFSHβ的融合方向或者二者之間的連接序列,并不能進(jìn)一步提高融合蛋白的產(chǎn)量。通過分析胞內(nèi)蛋白,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大量重組蛋白仍殘留在胞內(nèi),不能有效地被分泌到胞外,且重組蛋白在C端發(fā)生了降解。為了減少HSA-pFSHβ的降解或提高其分泌效率,本實(shí)驗(yàn)嘗試了YPS1基因(編碼的蛋白能夠從C端切割堿性氨基酸)缺失性菌株或更換信號肽。結(jié)果表明,敲除YPS1基因能夠減少上清中降解片段的產(chǎn)生,HSA或MSP信號肽能有效地將HSA-pFSHβ蛋白分泌到胞外,但是YPS1基因缺失或更換信號肽均不能進(jìn)一步提高HSA-pFSHβ的胞外產(chǎn)量。為了驗(yàn)證重組蛋白的生物學(xué)活性,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)HSA-pFSHα和HSA-pFSHβ蛋白的H3-3菌株,并在H3-3菌株基礎(chǔ)上,摸索HSA-pFSH蛋白表達(dá)的最適pH值、甲醇濃度及在高密度發(fā)酵條件下的產(chǎn)量。結(jié)果表明,搖瓶水平上HSA-pFSH蛋白表達(dá)的最優(yōu)pH值和甲醇濃度分別在5.0-6.0和1.5-2%之間,且上清中的重組蛋白經(jīng)純化后產(chǎn)量可以達(dá)到40.8 mg/l;高密度發(fā)酵條件下HSA-pFSH的產(chǎn)量可以達(dá)到6g/l的水平,但是大量蛋白發(fā)生了降解。接下來本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬FSHR的HEK293細(xì)胞系(HEK293-FSHR),并通過胞內(nèi)cAMP的變化來檢測HSA-pFSH的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示,重組HSA-pFSH蛋白可以有效地刺激HEK293-FSHR細(xì)胞中cAMP的合成,提示重組HSA-pFSH具有生物學(xué)活性。此外,在豬卵母細(xì)胞體外成熟實(shí)驗(yàn)中,HSA-pFSH可以顯著地刺激卵丘卵母細(xì)胞(COCs)擴(kuò)張,同樣證實(shí)其較好的生物學(xué)活性。另外,本實(shí)驗(yàn)探究了不同抗氧化劑及共表達(dá)分子伴侶對HSA-pFSHp分泌效率及產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,添加抗氧化劑A可以明顯地提高HSA-pFSHβ蛋白分泌效率,而且其作用效果可能與分子伴侶或囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。其他抗氧化劑并沒有類似的效果,提示抗氧化劑A提高重組效率的機(jī)制可能并不依賴其抗氧化活性。另外,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加抗氧化劑A與共表達(dá)分子伴侶PDI、ERO1或BiP具有協(xié)同作用,能夠?qū)釮SA-pFSHβ的產(chǎn)量提高4-15倍。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過一系列的分子策略和培養(yǎng)條件優(yōu)化,重組HSA-pFSH蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)量提高15倍,為大規(guī)模重組表達(dá)pFSH提供有價(jià)值的參考。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S828
【部分圖文】：

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐第一章文獻(xiàn)綜述逡逑第一章文獻(xiàn)綜述逡逑１．１研究目的和意義逡逑隨著克隆羊Ｄｏｌｌｙ的誕生，體細(xì)胞克隆所需要的生物技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。其中，逡逑胚胎移植是克隆技術(shù)必要的手段和環(huán)節(jié)。如何得到大量優(yōu)質(zhì)的成熟卵母細(xì)胞就成了影逡逑響移植效果的關(guān)鍵因素。自然發(fā)情時(shí)，動物卵巢上只有１％的有腔卵泡能夠發(fā)育成熟逡逑而排卵，其余９９％的發(fā)生閉鎖而退化，如果在黃體期結(jié)束后，卵泡期啟動之前注射外逡逑源促性腺激素，卵巢上會有更多的卵母細(xì)胞成熟并排出，這種方法稱為超數(shù)排卵逡逑（Ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ），簡稱超排［１］。牛、羊超排效果較好的方法是使用了邋ＦＳＨ的逡逑ＣＩＤＲ＋ＦＳＨ＋ＰＧ法（如圖１－１），但是由于促卵泡素（ＦＳＨ）的價(jià)格高，批量處理畜禽逡逑的成本大，一定程度上限制了邋ＦＳＨ在畜牧業(yè)中的廣泛使用。逡逑

大學(xué)博士學(xué)位論文邐第一章文獻(xiàn)９］。但是進(jìn)入高爾基體后，哺乳動物細(xì)胞糖基化加工途徑與酵母糖基樣。酵母細(xì)胞高爾基體內(nèi)蛋白加工途徑比哺乳動物細(xì)胞簡單，在分泌，最終加工好的蛋白的Ｎ－型糖基化為高甘露糖型糖基化，與哺乳動物有區(qū)別。這些區(qū)別可能會影響外源蛋白在酵母高爾基體的正確修飾，，阻礙畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。為此，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ＼＾0２等［１１１］發(fā)現(xiàn)畢赤酵母可以表達(dá)與哺乳動物類似的Ｎ－型糖基化蛋白，ｂｓ等［１１２］在此基礎(chǔ)上，成功地實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性糖基轉(zhuǎn)移酶基因０ＣＨ１的突酶的介入，使改造后的畢赤酵母能夠分泌表達(dá)與哺乳動物類似的Ｎ－。這些表達(dá)菌株能夠從Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ公司購買到，網(wǎng)ｗｗ．ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ。逡逑

促進(jìn)卵泡的生長并排卵，故可以通過測量ｃＡＭＰ的增量或者卵丘卵母細(xì)胞擴(kuò)張程度逡逑來反映ＦＳＨ的活性［５８，１５７］。另外，ＦＳＨ與顆粒細(xì)胞上的ＦＳＨＲ結(jié)合，經(jīng)蛋白激酶Ａ逡逑（ＰＫＡ）促進(jìn)雌二醇的產(chǎn)生并將其分泌到培養(yǎng)液中（如圖１－４），因此，測量培養(yǎng)液中逡逑雌二醇的含量也能反映ＦＳＨ的生物學(xué)活性［６２］。除此之外，研宄人員在體外構(gòu)建了穩(wěn)逡逑定表達(dá)ＦＳＨＲ的細(xì)胞系，用以檢測ＦＳＨ的生物學(xué)活性的研究，例如人ＦＳＨＲ的Ｙ１細(xì)逡逑１６逡逑

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本文編號：2823197