豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)能夠引發(fā)豬急性高度接觸性的消化道傳染病,即豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)。感染動(dòng)物以嘔吐、嚴(yán)重的腹瀉、脫水為主要癥狀,而且經(jīng)常同其他疾病混合發(fā)生,所有品種和年齡的豬對(duì)此病毒都易感,新生仔豬尤為嚴(yán)重,隨著日齡的增大死亡率逐漸下降。豬傳染性胃腸炎病毒包膜突起形狀的S蛋白在病毒表面,介導(dǎo)粘合到宿主受體和膜融合,其可以分為S1和S2區(qū)域,S蛋白是病毒中和抗體產(chǎn)生的一個(gè)主要的靶點(diǎn)。自上世紀(jì)90年代以來,TGEV導(dǎo)致了全球性的嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,一些疫苗制備技術(shù)被發(fā)展和商業(yè)化,目前國(guó)內(nèi)主要為豬傳染性胃腸炎病毒-豬輪狀病毒-豬流行性腹瀉病毒三價(jià)弱毒疫苗,但存在免疫效果不確實(shí)和返祖等缺陷,故TGEV新型高效疫苗研究尤為迫切,其中以新型基因工程疫苗的研究和開發(fā)為熱點(diǎn)。豬白細(xì)胞介素12(Porcine interleukin 12,pIL-12)是一種重要的多功能免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,IL-12能誘導(dǎo)干擾素γ(Interferonγ,IFN-γ)產(chǎn)生并且引發(fā)CD4~+T細(xì)胞分化為Th1(T輔助細(xì)胞)型細(xì)胞,IL-12有多種重要的生物學(xué)功能,它關(guān)系到早期非特異性的先天免疫和之后的特異性抗原獲得性免疫,可作為免疫佐劑提高疫苗的免疫保護(hù)效果。本研究對(duì)遼寧省撫順市60個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行了TGEV感染分布情況的調(diào)查,對(duì)有腹瀉癥狀的仔豬共采集了300份樣品,通過RT-PCR方法對(duì)TGEV的感染情況進(jìn)行了調(diào)查,并對(duì)TGEV關(guān)鍵基因S基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過分子生物學(xué)技術(shù)利用pVAX1載體,分別構(gòu)建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和豬IL-12基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK細(xì)胞中,通過免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)其蛋白表達(dá)。選取20頭7日齡無TGEV病原感染和抗體的仔豬隨機(jī)分成5組,分別是pIL-12+TGEV-S1組、TGEV-S1組、pIL-12組、pVAX1組、空白組,從7日齡開始,用重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)免疫,每次免疫間隔14天,共免疫3次,每間隔7天采集血液樣品,并于第三次免疫后7天進(jìn)行攻毒,攻毒后5天捕殺豬只并采集血液及組織學(xué)樣品。采集樣品通過淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、組織冰凍切片熒光檢測(cè)和HE染色等方法,分別對(duì)不同組別及不同日齡仔豬樣品進(jìn)行了細(xì)胞免疫和體液免疫及免疫保護(hù)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明,遼寧省撫順市60個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的300份樣品,共檢測(cè)出陽性樣品3份,通過對(duì)S基因的克隆測(cè)序、結(jié)構(gòu)分析、序列同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析和蛋白結(jié)構(gòu)分析,與其他17個(gè)參考毒株的S基因相比較,有5處核苷酸的變異,造成了4處氨基酸的變化,有1處氨基酸的變化導(dǎo)致了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,與WH1、Almazan毒株S基因的同源性和親源性最高,屬于Purdue毒株分支,與目前普遍流行的毒株相近。試驗(yàn)構(gòu)建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和豬IL-12基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35),將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后,所表達(dá)的蛋白通過免疫熒光試驗(yàn)都能夠被其特異性多克隆抗體檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn),TGEV-S1組和pIL-12+TGEV-S1兩種重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫組,在不同的免疫指標(biāo)檢測(cè)中,有不同程度的升高,相比較于空白組和pVAX1組有明顯的差異,其中pIL-12+TGEV-S1組的結(jié)果尤為顯著。在淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、TGEV S1特異性IgG抗體檢測(cè)、TGEV中和抗體檢測(cè)中,TGEV-S1組和pIL-12+TGEV-S1組有明顯升高,其中pIL-12+TGEV-S1組尤為明顯,與TGEV-S1組相比較差異顯著(p0.05),與空白組、pVAX1組、pIL-12組相比較差異極顯著(p0.01)。在CD4~+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)、CD8~+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)、IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞檢測(cè)中,pIL-12組、TGEV-S1組和pIL-12+TGEV-S1組都有明顯升高,其中pIL-12+TGEV-S1組尤為明顯,與空白組、pVAX1組相比較差異極顯著(p0.01)。腸道組織病毒分布的免疫熒光檢測(cè)和病理組織學(xué)檢查表明,TGEV-S1組和對(duì)照組之間差異明顯,其中pIL-12+TGEV-S1聯(lián)合免疫組病毒含量更少,組織損傷更輕。說明pIL-12作為免疫佐劑在仔豬機(jī)體免疫應(yīng)答方面有輔助增強(qiáng)的作用,能夠提高pVAX1-TGEV-S1真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果。本研究首次將TGEV S1基因與pIL-12基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒共同免疫仔豬,觀察仔豬免疫應(yīng)答水平及免疫保護(hù)效果,結(jié)果顯示佐劑pIL-12與TGEV S1抗原基因的聯(lián)合使用,能夠明顯的促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答,也能夠在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮一定作用,從而提高機(jī)體免疫水平對(duì)抗病毒感染。為新型核酸疫苗和細(xì)胞因子免疫佐劑免疫作用和免疫機(jī)理的深入研究進(jìn)一步提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.28
【部分圖文】：

1-1 TGEV 電鏡照片，標(biāo)尺為 100nctron microscope picture of TGEV, b毒的分類巢狀病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒義 RNA 病毒，冠狀病毒（Corona18,19]，危害最大就是 2002 到 2003 ；目前根據(jù)冠狀病毒的抗原和遺傳GEV）就屬于 Alpha 冠狀病毒，CCoV）等，它們?cè)谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)和感染（MHV）、嚴(yán)重急性呼吸器官綜合，他們都能夠引發(fā)肺炎并造成高死冠狀病毒，包括鵯冠狀病毒（Bulb毒的理化性質(zhì)

這些多重復(fù)基因在不同的冠狀病毒中其數(shù)量也不相同，例如，TGEV 有 3 個(gè)附加基因，PDCoV有 2 個(gè)，而 PEDV 只有 1 個(gè)[15,53]。1.2.2 豬傳染性胃腸炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因TGEV RNA 基因被 N 蛋白包裝成一個(gè)螺旋核衣殼。此外這個(gè)結(jié)構(gòu)的作用，N 蛋白能夠延長(zhǎng)細(xì)胞周期的 S 階段，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，上調(diào)白細(xì)胞介素 8 的表達(dá)和對(duì)抗 I 型干擾素的產(chǎn)生[93,94]。包膜突起形狀的 S 蛋白在病毒表面，介導(dǎo)粘合到宿主受體和膜融合，其可以分為 S1和 S2 區(qū)域，在一些冠狀病毒中 S 蛋白被細(xì)胞蛋白酶或胰蛋白酶加工為 S1 和 S2 碎片[95,96]，S蛋白是病毒中和抗體產(chǎn)生的一個(gè)主要的靶點(diǎn)[97]。M 蛋白是最多的病毒粒子成分，而且含有保守的線性 B 細(xì)胞表位[98]。E 蛋白在病毒粒子的裝配起重要作用，并且其能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上調(diào)白介素 18 的表達(dá)[99]。附屬的基因?qū)τ诓《驹隗w外的生長(zhǎng)是非必須的，但是他們也許在病毒存活于感染宿主中時(shí)起重要作用，的確，TGEV 附屬基因 ORF7 的產(chǎn)生減少了免疫系統(tǒng)的抗病毒防御相關(guān)基因的表達(dá)，例如干擾素的應(yīng)答和炎癥[67]。TGEV 3' 末端的轉(zhuǎn)錄樣 RNA序列，鑒定為 γ 干擾素（二型干擾素）活性抑制劑調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答[100]，有趣的是有報(bào)道，PEDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白之一 nsp1，是一個(gè) I 型干擾素的抑制劑[101]，而 PDCoV 缺少 nsp1 基因[15]。TGEV 有 1 個(gè)小的開放閱讀框出現(xiàn)在下游區(qū)到 N 基因，其分別對(duì)病毒毒力和病毒復(fù)制/裝配起到重要作用[102]。

ORF1a 編碼的 nsp3 木瓜樣蛋白水解酶和 nsp5 3C 樣蛋白水蛋白（nsp），ORF1a 編碼了 nsp1 到 nsp11，ORF1b 編碼了構(gòu)蛋白編碼了重要的功能蛋白，例如 PLpro（nsp3）、3CLpro（Pol）（nsp12）和解鏈酶（nsp13），TGEV 有兩個(gè) PLpr（oPL1p的基因序列被頻繁的用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[53]。冠狀病毒復(fù)制A 依賴性 RNA 聚合酶和解旋酶活性，還編碼了其他酶類，例糖核酸外切酶、2' -氧-核糖甲基轉(zhuǎn)移酶、核糖腺苷二磷酸 1' 聚合酶，這在 RNA 病毒中特殊而且很少見[19,138]。宿主基因表達(dá)的抑制和干擾宿主免疫應(yīng)答，然而機(jī)制還不清sp1 結(jié)構(gòu)信息是 β 冠狀病毒 SARS-CoV 的 nsp1 氨基末端的核S-CoV 的 nsp1 能夠抑制 I 型干擾素有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯， M 首次報(bào)道了 α 冠狀病毒的 nsp1 結(jié)構(gòu)，TGEV 的 nsp1，其邊緣伴隨一個(gè)長(zhǎng)的 α 螺旋，與 SARS-CoV 的 nsp1 折疊一致p1 結(jié)構(gòu)啟發(fā)了冠狀病毒 nsp1 有一個(gè)共同的起源，盡管缺少序 nsp1 抑制宿主基因的表達(dá)機(jī)制是不同的，對(duì)比 α 冠狀病毒電、形狀和氨基酸，提示不同的機(jī)制是由同源異途進(jìn)化所致

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2823086