目前動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病毒類疫苗的生產(chǎn)中。國(guó)外應(yīng)用該技術(shù)生產(chǎn)的流感病毒細(xì)胞疫苗已通過(guò)安全認(rèn)證并在臨床上得到廣泛使用。而我國(guó)的流感疫苗生產(chǎn)仍以落后的雞胚工藝為主。雞胚苗因其生產(chǎn)存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、效率低、批量小、易污染、成本高,發(fā)病時(shí)還可能出現(xiàn)SPF雞胚供應(yīng)不足、應(yīng)急能力差等缺陷,在生產(chǎn)實(shí)踐中已日趨淘汰。為了提高流感疫苗的產(chǎn)量、質(zhì)量和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,盡快開(kāi)發(fā)生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒細(xì)胞苗的工藝技術(shù),成為我國(guó)疫苗生產(chǎn)企業(yè)急待攻克的技術(shù)難關(guān)。當(dāng)前,疫苗企業(yè)在開(kāi)發(fā)流感細(xì)胞疫苗中發(fā)現(xiàn),在大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),流感病毒增殖效率較低,不能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到配制疫苗所要求的病毒滴度,限制了流感病毒細(xì)胞苗的開(kāi)發(fā)速度。據(jù)報(bào)道犬腎來(lái)源的MDCK細(xì)胞對(duì)流感病毒敏感,在獸用疫苗生產(chǎn)中已得到應(yīng)用。本文通過(guò)將兩株甲型H1N1和H3N2流感病毒疫苗毒毒株,分別在SPF雞胚中增殖、擴(kuò)增,構(gòu)建工作種毒庫(kù),進(jìn)行了生物學(xué)鑒定。然后在MDCK貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)、增殖適應(yīng)與傳代馴化,探索了兩株流感病毒在MDCK細(xì)胞系上的培養(yǎng)、增殖條件與規(guī)律,確定了最佳病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)、最佳接毒與收毒時(shí)間,提高了兩株流感病毒在MDCK貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞上增殖后的血凝效價(jià)(HA)和病毒滴度(CCID_(50))。其中甲型H1N1株在MDCK貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞中增殖時(shí),其HA均可達(dá)到2~8HA units/25μl;CCID_(50)分別可達(dá)到7.50TU/ml和7.32TU/ml;甲型H3N2在兩種MDCK細(xì)胞中復(fù)制,所得毒液的HA略低于H1N1,最高可達(dá)2~7HA units/25μl,CCID_(50)最高分別可達(dá)7.12 TU/ml和6.79TU/ml,能夠滿足疫苗生產(chǎn)對(duì)抗原含量的要求。最后,根據(jù)優(yōu)化后的病毒培養(yǎng)條件參數(shù),分別將兩株病毒在MDCK貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞上培養(yǎng)、擴(kuò)增,然后收毒、凍存,進(jìn)行生物學(xué)鑒定,建立了兩株病毒的細(xì)胞毒工作代毒庫(kù)和種子毒毒庫(kù),為后續(xù)利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感病毒細(xì)胞疫苗,奠定了病毒基礎(chǔ),對(duì)以MDCK細(xì)胞為培養(yǎng)基質(zhì)的流感病毒細(xì)胞疫苗的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)具有重要意義。
【學(xué)位單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在甲型流感病毒表面除了血凝素和神經(jīng)氨酸酶外，還存在量較少的跨膜蛋白離子通道蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中基質(zhì)蛋白是流感病毒中多的蛋白，它位于病毒粒子雙層脂質(zhì)膜的下邊，構(gòu)成了病毒包膜的框架[17HA 由 RNA4 編碼,含 HA1 和 HA2 兩個(gè)亞單位，負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞表液酸受體結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞，NA 由 RNA6 編碼，它與新產(chǎn)生的病毒從的細(xì)胞中釋放出來(lái)的過(guò)程有關(guān)[17]。一個(gè)成熟的病毒顆粒結(jié)構(gòu)可分三層，為雙層類脂囊膜，它來(lái)自宿主細(xì)胞，囊膜上散布著形態(tài)不一的蛋白突起，似三角形的細(xì)長(zhǎng)棒，是凝集紅細(xì)胞的血球凝集素 HA；另一種呈蘑菇狀，毒顆粒從凝集的紅細(xì)胞表面釋放出來(lái)的神經(jīng)氨酸酶 NA，HA 和 NA 在囊例約 4：1；還有一種突起為膜蛋白 M2，三種突起均插入類脂膜并以疏水酸為錨固定在類脂膜，與基質(zhì)蛋白 M1 相接觸。類脂囊膜下面的中間層1 構(gòu)成的單分子或若干分子厚的球形蛋白殼。最里層是裹在球形蛋白殼中體，呈螺旋對(duì)稱[33]。甲型流感病毒具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 1。

西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文（續(xù)表）毒種 細(xì)胞接種密度 HA CCID50甲型H3N2 X-263B1.0×104cells/cm2265.121.5×104cells/cm2266.852.0×104cells/cm2277.003.0×104cells/cm2276.90

西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文（續(xù)表）毒種 細(xì)胞接種密度 HA CCID50甲型H3N2 X-263B1.0×104cells/cm2265.121.5×104cells/cm2266.852.0×104cells/cm2277.003.0×104cells/cm2276.90

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2822810