目前動物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)技術被廣泛應用于病毒類疫苗的生產(chǎn)中。國外應用該技術生產(chǎn)的流感病毒細胞疫苗已通過安全認證并在臨床上得到廣泛使用。而我國的流感疫苗生產(chǎn)仍以落后的雞胚工藝為主。雞胚苗因其生產(chǎn)存在勞動強度大、效率低、批量小、易污染、成本高,發(fā)病時還可能出現(xiàn)SPF雞胚供應不足、應急能力差等缺陷,在生產(chǎn)實踐中已日趨淘汰。為了提高流感疫苗的產(chǎn)量、質(zhì)量和市場競爭力,盡快開發(fā)生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產(chǎn)流感病毒細胞苗的工藝技術,成為我國疫苗生產(chǎn)企業(yè)急待攻克的技術難關。當前,疫苗企業(yè)在開發(fā)流感細胞疫苗中發(fā)現(xiàn),在大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞內(nèi),流感病毒增殖效率較低,不能在短時間內(nèi)達到配制疫苗所要求的病毒滴度,限制了流感病毒細胞苗的開發(fā)速度。據(jù)報道犬腎來源的MDCK細胞對流感病毒敏感,在獸用疫苗生產(chǎn)中已得到應用。本文通過將兩株甲型H1N1和H3N2流感病毒疫苗毒毒株,分別在SPF雞胚中增殖、擴增,構建工作種毒庫,進行了生物學鑒定。然后在MDCK貼壁細胞和懸浮細胞上進行培養(yǎng)、增殖適應與傳代馴化,探索了兩株流感病毒在MDCK細胞系上的培養(yǎng)、增殖條件與規(guī)律,確定了最佳病毒感染復數(shù)(MOI)、最佳接毒與收毒時間,提高了兩株流感病毒在MDCK貼壁細胞和懸浮細胞上增殖后的血凝效價(HA)和病毒滴度(CCID_(50))。其中甲型H1N1株在MDCK貼壁細胞和懸浮細胞中增殖時,其HA均可達到2~8HA units/25μl;CCID_(50)分別可達到7.50TU/ml和7.32TU/ml;甲型H3N2在兩種MDCK細胞中復制,所得毒液的HA略低于H1N1,最高可達2~7HA units/25μl,CCID_(50)最高分別可達7.12 TU/ml和6.79TU/ml,能夠滿足疫苗生產(chǎn)對抗原含量的要求。最后,根據(jù)優(yōu)化后的病毒培養(yǎng)條件參數(shù),分別將兩株病毒在MDCK貼壁細胞和懸浮細胞上培養(yǎng)、擴增,然后收毒、凍存,進行生物學鑒定,建立了兩株病毒的細胞毒工作代毒庫和種子毒毒庫,為后續(xù)利用生物反應器培養(yǎng)MDCK細胞生產(chǎn)流感病毒細胞疫苗,奠定了病毒基礎,對以MDCK細胞為培養(yǎng)基質(zhì)的流感病毒細胞疫苗的開發(fā)與生產(chǎn)具有重要意義。
【學位單位】：西北民族大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

同時發(fā)現(xiàn)，在甲型流感病毒表面除了血凝素和神經(jīng)氨酸酶外，還存在量較少的跨膜蛋白離子通道蛋白。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中基質(zhì)蛋白是流感病毒中多的蛋白，它位于病毒粒子雙層脂質(zhì)膜的下邊，構成了病毒包膜的框架[17HA 由 RNA4 編碼,含 HA1 和 HA2 兩個亞單位，負責病毒與宿主細胞表液酸受體結合并進入宿主細胞，NA 由 RNA6 編碼，它與新產(chǎn)生的病毒從的細胞中釋放出來的過程有關[17]。一個成熟的病毒顆粒結構可分三層，為雙層類脂囊膜，它來自宿主細胞，囊膜上散布著形態(tài)不一的蛋白突起，似三角形的細長棒，是凝集紅細胞的血球凝集素 HA；另一種呈蘑菇狀，毒顆粒從凝集的紅細胞表面釋放出來的神經(jīng)氨酸酶 NA，HA 和 NA 在囊例約 4：1；還有一種突起為膜蛋白 M2，三種突起均插入類脂膜并以疏水酸為錨固定在類脂膜，與基質(zhì)蛋白 M1 相接觸。類脂囊膜下面的中間層1 構成的單分子或若干分子厚的球形蛋白殼。最里層是裹在球形蛋白殼中體，呈螺旋對稱[33]。甲型流感病毒具體結構見圖 1。

西北民族大學生命科學與工程學院 2019 屆碩士研究生學位論文（續(xù)表）毒種 細胞接種密度 HA CCID50甲型H3N2 X-263B1.0×104cells/cm2265.121.5×104cells/cm2266.852.0×104cells/cm2277.003.0×104cells/cm2276.90

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【參考文獻】

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1 蔡立英;;預防流感大流行[J];世界科學;2014年05期

2 楊顏慈;郭斌;殷紅;;無血清培養(yǎng)基的成分改進及應用現(xiàn)狀[J];生物學雜志;2013年01期

3 張韌;王建超;陳文慶;劉華杰;高飛;徐舸辰;林龍飛;;反應器細胞懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)技術在動物疫苗生產(chǎn)中的應用[J];中國獸藥雜志;2012年11期

4 熊成龍;張志杰;梁笛;蔣露芳;陸一涵;居麗雯;陳躍;姜慶五;;甲型流感病毒血凝素基因的進化與分型研究[J];復旦學報(醫(yī)學版);2011年04期

5 吳歡歡;李玉蘋;;甲型H1N1流行性感冒重癥與危重癥患者臨床特征分析[J];醫(yī)學研究雜志;2011年04期

6 鐘瑩;;從甲型H1N1流感病毒事件看我國突發(fā)公共衛(wèi)生事件的信息發(fā)布[J];首都醫(yī)藥;2010年18期

7 李春艷;肖晶;李曦;劉娣;;微載體規(guī)�；囵B(yǎng)MDCK細胞增殖H9N2亞型禽流感病毒的研究[J];中國人獸共患病學報;2009年12期

8 杜寧;王大燕;舒躍龍;;2009新甲型H1N1流感病毒病原學概述[J];病毒學報;2009年06期

9 李穎;;甲流病毒主要通過飛沫傳播[J];中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學專業(yè)半月刊);2009年18期

10 雷達;艾立新;鄧紅櫻;丁國允;;流感大流行特征啟示甲型H1N1流感防控策略[J];中國國境衛(wèi)生檢疫雜志;2009年03期

相關博士學位論文 前5條

1 敬岳;流行性感冒中醫(yī)證候?qū)W特征橫斷面調(diào)查及隨訪研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2017年

2 劉林青;H5N1流感病毒感染孕鼠的機制以及養(yǎng)禽業(yè)人員禽流感感染風險調(diào)查[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2014年

3 程凱慧;H6N1亞型禽流感對哺乳動物的傳播與致病機制研究[D];石河子大學;2013年

4 鄒鎮(zhèn);H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸損傷的機理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2012年

5 陳昊陽;我國重大傳染病態(tài)勢及對國家人口安全影響的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2007年

相關碩士學位論文 前4條

1 鄭鋒玲;甲型H1N1流感患者中醫(yī)臨床癥狀分析與溫病患者相關指標研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2016年

2 邱雨晨;甲型H1N1流感中西醫(yī)診療研究進展概述[D];北京中醫(yī)藥大學;2015年

3 高偉星;甲型H1N1流感亞單位疫苗生產(chǎn)工藝研究[D];吉林大學;2015年

4 姚志東;MDCK細胞培養(yǎng)的甲型H1N1流感病毒疫苗研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2011年

本文編號：2822810