為了提高雞球蟲病活疫苗免疫效果,增強免疫保護力,降低活疫苗副作用,縮短免疫產(chǎn)生期,通過以雞白介素4(chIL-4)和雞白介素2(chIL-2)為研究對象,構(gòu)建新型細(xì)胞因子免疫佐劑chIL-4和chIL-2融合基因表達載體,研究該融合基因的佐劑作用。試驗結(jié)果表明:(1)采用基因合成與雙酶切連接技術(shù),經(jīng)測序鑒定成功構(gòu)建攜帶雞白介素4、雞白介素2以及二者融合基因的重組真核表達載體pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP。(2)采用HilyMax脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞C2C12,對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化,在熒光顯微鏡下觀察,通過IPP軟件分析其累計光密度值。結(jié)果表明,重組載體pCI-chIL-2-EGFP能在小鼠成肌細(xì)胞內(nèi)正確表達,DNA與Hilymax脂質(zhì)體比例為1:3時細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高(29.65%±2.58%),轉(zhuǎn)染72h后蛋白表達量達到最高。(3)將構(gòu)建的 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚盲腸上皮細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞,24h-96hmRNA表達量均先升高后降低,48h極顯著(P0.01)高于其他時間段,達到峰值;累積光密度值先升高后降低,72h顯著(P0.05)或極顯著(P0.01)高于24h和48h,達到峰值,到96h已檢測不到;細(xì)胞上清液熒光強度先升高后降低,72h極顯著(P0.01)高于其余三個時間段,達到峰值。轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞24h-96h,mRNA和蛋白表達量均先升高后降低,mRNA 48h和蛋白72h極顯著高于其他時間段,達到峰值;細(xì)胞上清液熒光強度先升高后降低,72h極顯著(P0.01)高于其余三個時間段,達到峰值,表明三種重組質(zhì)粒均能在三種細(xì)胞中進行表達,并能持續(xù)72h以上,三種重組蛋白均能分泌到細(xì)胞外,并在72h達峰值。(4)pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚盲腸上皮細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞和小鼠成肌細(xì)胞三種細(xì)胞24h-96h的上清液均能極顯著(P0.01)促進雞脾淋巴細(xì)胞的增殖,刺激指數(shù)均先升高后降低,72h達峰值,表明三種重組蛋白都具有生物學(xué)活性;而pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液對雞脾淋巴細(xì)胞的增殖極顯著(P0.01)高于另外兩種重組質(zhì)粒,表明chIL-4-chIL-2融合蛋白的生物學(xué)活性顯著高于chIL-4重組蛋白或chIL-2重組蛋白。
【學(xué)位單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S858.31
【部分圖文】：

圖５邋ｐＣＩ－ｃｈＩＬ－２－ＥＧＦＰ質(zhì)粒測序峰圖逡逑－３２－逡逑

碑卜chIL~4一E濟P質(zhì)粒測序結(jié)果

圖７邋ｐＣＩ－ｃｈＩＬ－４－ＥＧＦＰ質(zhì)粒測序峰圖逡逑

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