鴨甲型肝炎(Duck hepatitis A,DHA)是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一,可引起雛鴨的急性、高度致死性的傳染病。根據(jù)其基因序列的差異,分為三個基因型(DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C),目前我國主要流行DHAV-A和DHAV-C,兩種基因型病毒缺乏有效的交叉中和作用,嚴重影響本病的防控。研究表明,針對保守中和抗原表位的廣譜中和抗體是應(yīng)對這種情況的新策略。本研究擬針對DHAV-A和DHAV-C共同保護性抗原的保守序列研制單克隆抗體(Monoclonal antibody,McAb),進而篩選出針對這兩種基因型DHAV的廣譜中和抗體,取得如下成果:1研制出與DHAV-A和DHAV-C具有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體根據(jù)DHAV-A和DHAV-C的VP1蛋白共有的氨基酸序列,利用生物信息學軟件設(shè)計篩選出評分最高的12條長度為14肽的抗原表位,人工合成各肽段,分別與KLH載體蛋白偶聯(lián)作為免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制備McAb,獲得了12株穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細胞株。間接ELISA檢測結(jié)果顯示,其中6株McAb(C1、C4、C7、C12、C13、C16)同時與DHAV-A和DHAV-C發(fā)生交叉反應(yīng),而不與鴨瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)反應(yīng),為廣譜中和McAb的篩選奠定了基礎(chǔ)。2篩選出具有交叉中和活性的單克隆抗體2.1 McAb在鴨胚中的交叉中和活性為評價McAb的中和活性,將具有交叉反應(yīng)性McAb分別與200ELD_(50)DHAV-A和DHAV-C等體積混,接種12日齡SPF鴨胚絨毛尿囊腔,0.2mL/胚,進行中和試驗,每個處理組5枚鴨胚,以鴨β-actin基因作為內(nèi)參,采用Real-time PCR方法測定病毒荷載量,用2~(-△△CT)法進行相對定量,評價6株具有交叉反應(yīng)性的McAb對DHAV-A和DHAV-C的在鴨胚上的中和活性,并測定其中和效價。結(jié)果顯示,6株McAb對DHAV-A和DHAV-C增殖的抑制率依次為:C1(84.4%82.69%)、C4(90.79%75.34%)、C7(86.23%99.83%)、C12(14.74%25.26%)、C13(38.87%2.06%)和C16(99.61%100%)。鴨胚中和試驗結(jié)果中,6株McAb對DHAV-A、DHAV-C的中和效價分別為:C1(1:31:5)、C4(1:31:3)、C7(1:101:11)、C12(00)、C13(00)和C16(1:91:9)。據(jù)此篩選出4株(C1、C4、C7、C16)具有交叉中和活性的McAb。2.2 McAb對雛鴨的預(yù)防效果為了解4株對DHAV-A、DHAV-C具有交叉中和活性McAbs對雛鴨的交叉預(yù)防效果,1日齡雛鴨分組肌肉注射McAb,1mL/只,24 h后分別肌注DHAV-A、DHAV-C,100ELD_(50)/只,每個處理組5只雛鴨。結(jié)果顯示,4株McAb對DHAV-A、DHAV-C的保護率分別為:C1(30%40%)、C4(40%40%)、C7(70%80%)、C16(100%60%)。本研究結(jié)果顯示,4株McAbs對兩種不同基因型毒株均具有不同程度的交叉預(yù)防效果,其中C7、C16對DHAV-A和DHAV-C的攻擊具良好的交叉預(yù)防作用,保護率達60%以上。
【學位單位】：西南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

圖1 DHAV-A和DHAV-CVP1 蛋白共有表位氨基酸序列的分析結(jié)果Fig.1 Epitope analysis of VP1 amino acid sequences shared by DHAV-Aand DHAV-C表2 共有抗原表位的信息

圖 2 雜交瘤細胞株生長形態(tài)(100×) A:第1代；B:第5代；C:第15代；D:第20代Figure 2 Hybridoma cell line growth morphology (100×) A: 1st generation; B: 5thgeneration; C: 15th generation; D: 20th generation 討論

圖 4 DHAV-A 攻毒組雛鴨生存曲線Fig.4 Duck survival curve of DHAV-A virus challenge group圖 5 DHAV-C 攻毒組雛鴨生存曲線Fig.5 Duck survival curve of DHAV-C virus challenge group從表 14、15 中可以看出 C7 和 C16 對兩種基因型病毒感染雛鴨都具有良好

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本文編號：2820149