發(fā)布時間：2020-09-15 11:15

　　 豬丹毒(Swine erysipelas)是由豬丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病。近幾年,該病的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。本實驗室前期在江淮地區(qū)42株豬丹毒絲菌臨床分離株(血清型均為1a型)中篩選出3株致病性強、抗原性好、遺傳穩(wěn)定的制苗用菌株。本研究通過對制苗用菌株生長培養(yǎng)基的篩選、甲醛滅活濃度和時間的摸索以及免疫佐劑的選擇三個方面來提高豬丹毒絲菌滅活疫苗的免疫原性,并與商品化疫苗進行免疫效果比較,以期為該病的防控及聯(lián)合疫苗的研究提供理論依據(jù)。將篩選出的3株制苗用菌株(AEr 21、AEr 31和AEr 32)作為受試菌株進行如下試驗:(1)利用平板菌落計數(shù)、OD_(600)值測定以及全菌體蛋白濃度測定的方法,比較受試菌株在含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB-YE)、豬丹毒疫苗培養(yǎng)基及改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中的生長狀況。(2)將終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液加入生長至穩(wěn)定期的受試菌株中,分別滅活5、9、10、11、12、13、14、15、20 h后,用液體培養(yǎng)基和動物試驗檢驗菌株的滅活情況。(3)受試菌株在終濃度為0.2%的甲醛滅活11h后,按不同比例分別與5種佐劑(弗氏佐劑、鋁膠佐劑、蜂膠佐劑、礦物油佐劑ISA 201 VG、聚合物佐劑)制備成豬丹毒絲菌滅活疫苗,經(jīng)物理性狀檢驗、無菌檢驗和安全檢驗合格后免疫小鼠,應用ELISA方法檢測小鼠血清中IgG抗體水平和細胞因子含量(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ),分別采用口服灌胃和腹腔注射方式進行攻毒保護性試驗,測定免疫保護力。(4)3株受試菌株在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中生長至穩(wěn)定期,經(jīng)終濃度為0.2%的甲醛滅活11h后,用礦物油佐劑ISA 201 VG制備的滅活疫苗與商品化疫苗同步免疫小鼠。應用ELISA方法檢測小鼠血清中IgG抗體水平和細胞因子含量(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ),流式細胞術(shù)測定CD4~+/CD3~+、CD8~+/CD3~+T細胞亞群,采用口服灌胃和腹腔注射方式測定攻毒保護率,并采集小鼠組織臟器(脾臟、肺臟、肝臟、腎臟)制備病理組織切片,觀察病理變化。結(jié)果顯示:(1)3株受試菌株(AEr 21、AEr31和AEr 32)在三種培養(yǎng)基中的菌落總數(shù)分別為3.8×10~8~6.1×10~8、3×10~9~3.8×10~9、4.75×10~9~5×10~9 CFU/mL、OD_(600)值分別為1.01~1.39、1.11~1.52、1.39~2.07、全菌體蛋白濃度分別為8.14~10.31、9.46~11.42、11.21~13.41 mg/mL。(2)終濃度為0.2%、0.3%、0.4%的甲醛滅活11h以上可將受試菌株全部滅活。(3)受試菌株與5種佐劑制備的滅活疫苗免疫小鼠后均可產(chǎn)生較好的細胞免疫和體液免疫,其中礦物油佐劑ISA 201 VG滅活疫苗組誘導產(chǎn)生的抗體和細胞因子水平最高,且與弗氏佐劑、鋁膠佐劑滅活疫苗組差異顯著(P0.05),與其他佐劑滅活疫苗組差異不顯著(P0.05);攻毒后,礦物油佐劑ISA201 VG滅活疫苗組的免疫保護率最高,分別為80%~100%、60%~80%。(4)AEr 21、AEr31、AEr 32全菌體滅活疫苗組和商品化弱毒、滅活疫苗組二次免疫小鼠后的血清IgG抗體效價分別為1:3200、1:6400、1:1600、1:6400、1:3200(以全菌體的超聲裂解物為包被抗原)和1:3200、1:6400、1:3200、1:25600、1:6400(以重組SpaA為包被抗原);商品化弱毒疫苗組誘導小鼠產(chǎn)生細胞因子含量和CD4~+/CD3~+、CD8~+/CD3~+T細胞比例最高,與滅活疫苗組差異顯著(P0.05),各滅活疫苗組間差異均不顯著(P0.05);AEr 21、AEr31、AEr 32全菌體滅活疫苗組和商品化弱毒、滅活疫苗組對口服灌胃和腹腔注射的攻毒保護率分別為80%、100%、100%、100%、100%和80%、100%、60%、100%、100%;AEr 21、AEr 32全菌體滅活疫苗組的病理組織變化較AEr31全菌體滅活疫苗組和商品化弱毒、滅活疫苗組更明顯。結(jié)果表明:受試菌株(AEr31株)以改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基作為生長條件、經(jīng)終濃度為0.2%的甲醛37℃振蕩滅活(150 r/min)11 h后,與礦物油佐劑ISA 201 VG制備成滅活疫苗的免疫效果最好,免疫小鼠后不僅可產(chǎn)生較高水平的細胞免疫和體液免疫,還可完全抵抗強毒株的攻擊。
【學位單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖 2-1 AEr 21 在三種培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 2-1 Growth curve of AEr 21 in three culture media② AEr31 在 TSB-YE 培養(yǎng)基中生長12 h~14 h達到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)最大值.1×108CFU/mL；在豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中生長12 h達到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)最大值為109CFU/mL；在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中生長12 h達到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)最大值.8×109CFU/mL。結(jié)果顯示，AEr 31在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中含菌量最多（見-2；圖2-2）。表 2-2 菌落計數(shù)法測定 AEr 31 在三種培養(yǎng)基中的生長情況Table 2-2 Determination of AEr 31 strain growth in three media by colony count時間 (h)細菌數(shù)（CFU/mL） 細菌的對數(shù)值 (lg)TSB-YE 培養(yǎng)基豬丹毒疫苗培養(yǎng)基改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基TSB-YE 培養(yǎng)基豬丹毒疫苗培養(yǎng)基改良豬丹毒疫培養(yǎng)基0 1.5×1061.5×1061.5×1066.176 6.176 6.176

圖 2-2 AEr 31 在三種培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 2-2 Growth curve of AEr 31 in three culture media③ AEr32 在 TSB-YE 培養(yǎng)基中生長10 h~12 h達到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)最大值.8×108CFU/mL；在豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中生長12 h達到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)最大值.5×109CFU/mL；在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中生長12 h達到穩(wěn)定期，菌落總數(shù)最為5×109CFU/mL。結(jié)果顯示，AEr 32 在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中含菌量最多（2-3；圖2-3）。表 2-3 菌落計數(shù)法測定 AEr 32 在三種培養(yǎng)基中的生長情況Table 2-3 Determination of AEr 32 strain growth in three media by colony count間 (h)細菌數(shù)（CFU/mL） 細菌的對數(shù)值 (lg)TSB-YE 培養(yǎng)基豬丹毒疫苗培養(yǎng)基改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基TSB-YE 培養(yǎng)基豬丹毒疫苗培養(yǎng)基改良豬丹毒疫苗養(yǎng)基01.5×1061.5×1061.5×1066.176 6.176 6.176

圖 2-3 AEr 32 在三種培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 2-3 Growth curve of AEr 32 in three culture media.2 OD600值測定結(jié)果受試菌株（AEr 21、AEr 31、AEr 32）分別在三種培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃振蕩培養(yǎng)（in）16 h，其間每隔2 h，即采用測定OD600值的方法檢測菌液濃度。① 相同的時間點，AEr 21在改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基中的OD600值最高，這一平板菌落計數(shù)的結(jié)果相一致，顯示改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基對AEr 21的生長效見表2-4）。表 2-4 OD600值測定 AEr 21 在三種培養(yǎng)基中的生長情況Table 2-4 Determination of AEr 21 growing sate in three media by the OD600時間(h)OD600值TSB-YE 培養(yǎng)基 豬丹毒疫苗培養(yǎng)基 改良豬丹毒疫苗培養(yǎng)基0 0 0 0

【參考文獻】

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本文編號：2818894