豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒病與豬偽狂犬病是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的三種重要傳染病,分別由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬輪狀病毒(Rotavirus,PoRV)和豬偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起。PEDV和PoRV主要導(dǎo)致仔豬腹瀉,PRV則引起母豬繁殖障礙及新生仔豬急性死亡,并伴有嘔吐、腹瀉、震顫和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀。三種病毒常�；旌细腥緦�(dǎo)致更大的危害,為了有效預(yù)防和控制這三種疾病,研究一種可同時(shí)預(yù)防這三種疾病的安全、高效的疫苗顯得迫切而必須。本項(xiàng)目擬用PoRV VP7和PEDV S基因的免疫優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)基因,以PRV XJ株作為活載體,同源重組構(gòu)建表達(dá)PEDV S、PoRV VP7的重組偽狂犬病病毒PRV(CM)株,并開展培養(yǎng)特性、遺傳穩(wěn)定性、安全性等生物學(xué)特性研究。1 PRV真核轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEGFP-VP7.S的構(gòu)建根據(jù)已有文獻(xiàn)對(duì)PEDV S基因和PoRV VP7基因優(yōu)勢(shì)抗原表位的研究,結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析,參照NCBI上PEDV和PoRV序列分別設(shè)計(jì)引物S-a/S-b和VP7-a/VP7-b,在引物上下游5’引入合適的酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基和柔性肽序列。RT-PCR擴(kuò)增出部分VP7和S基因作為本研究的候選基因片段,分別克隆至pMD19-T(Simple),構(gòu)建pMD-VP7、pMD-S克隆質(zhì)粒。對(duì)pMD-VP7、pMD-S克隆質(zhì)粒進(jìn)行Kpn I、BamH I雙酶切反應(yīng),回收目的片段連接轉(zhuǎn)化,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD-VP7.S,對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定,表明目的基因片段無堿基的突變和缺失,相應(yīng)酶切位點(diǎn)和柔性肽序列準(zhǔn)確引入。對(duì)pEGFP-gI28k真核表達(dá)載體和pMD-VP7.S重組質(zhì)粒用Xho I、Sal I雙酶切,回收目的片段,連接轉(zhuǎn)化,構(gòu)建含有VP7.S融合基因的PRV真核轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEGFP-VP7.S,對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序鑒定。2表達(dá)PEDV S和PoRV VP7基因的重組偽狂犬病毒PRV(CM)株的構(gòu)建將PRV真核轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEGFP-VP7.S和偽狂犬野毒株P(guān)RV XJ株共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,通過同源重組構(gòu)建了共表達(dá)VP7和S基因并且gI、gE毒力基因缺失的重組偽狂犬病毒PRV(CM)株,經(jīng)過PCR、Western-Blotting等鑒定,結(jié)果表明VP7和S基因成功表達(dá),重組病毒構(gòu)建成功。3 PRV(CM)株部分生物學(xué)特性研究通過將PRV(CM)接種到BHK-21細(xì)胞上,增值特性觀察發(fā)現(xiàn)VP7.S融合基因片段的插入不影響重組病毒株的增值,測(cè)定PRV(CM)的TCID_(50)和親本株相比較,重組病毒株的增值滴度略有降低;一步生長(zhǎng)曲線顯示重組病毒株和親本株具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué);將PRV(CM)在BHK-21細(xì)胞傳至20代,各代次病毒增殖規(guī)律相似;PCR測(cè)定顯示外源基因穩(wěn)定存在,毒力基因穩(wěn)定缺失;安全性試驗(yàn)結(jié)果表明,以不同病毒滴度的PRV(CM)接種哺乳仔豬和懷孕母豬,無臨床異常是安全的。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

圖 1：輪狀病毒病毒體的示意圖[96]Fig 1: Schematic diagram of rotavirus virions的主要抗原蛋白結(jié)構(gòu)蛋白 VP4、VP6、VP7 是目前公認(rèn)的和免疫相關(guān)的P6，中和抗原 VP7，血凝素抗原 VP4[6]。體存在，在細(xì)胞粘附和膜滲透中發(fā)揮作用，所以也叫黏酶可將 VP4 在第 241 或第 247 個(gè)氨基酸殘基處將其裂胰蛋白酶頂端 VP8*的凝集素球狀樣結(jié)構(gòu)域（65aa-224*的β-桶狀結(jié)構(gòu)域（264 aa -474 aa），各占“身體”兩邊的位長(zhǎng)繁殖能力。前人針對(duì) VP4 的中和抗體水平做了大量的病毒還是牛輪狀病毒，VP8*都包含了主要的抗原決定位優(yōu)于 VP5 蛋白的，在雞身上，VP8*也是優(yōu)于 VP6 的，但

表 2-6 pEGFP-gI28k 質(zhì)粒的酶切體系ble 2-6 Enzyme digestion of pEGFP-gI28k pla試劑 用量kCut Buffer 5 μLho I 1 μLSal I 1 μLdH2O 39 μL7.S 質(zhì)粒 DNA 4 μLotal 50 μL PoRV VP7 基因的擴(kuò)增結(jié)果PoRV SC-R 株分別進(jìn)行 S 基因和 VP7預(yù)期片段大小一致的約 1028bp 和 101

2-2 pMD-VP7、pMD-S 菌液 PCR 鑒 PCR identification results of pMD-VP因的PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照；3：VP product of S gene; 2: negative controlnegative control-S 克隆質(zhì)粒的序列測(cè)定-VP7、pMD-S 質(zhì)粒送生工生物，目的基因片段擴(kuò)增長(zhǎng)度和預(yù)期 Linker 序列正確引入，為后續(xù)的結(jié)果見附錄 1。原參數(shù)分析n 軟件分析測(cè)序結(jié)果的 S 基因和

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本文編號(hào)：2818469