益生菌具有多種生物學(xué)功能,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、保健等領(lǐng)域。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)益生菌生物活性的研究主要限于活菌,而在滅活益生菌方面的研究鮮有報(bào)道。已有研究發(fā)現(xiàn),益生菌活菌或死菌體均有多種相似的生理功能,滅活益生菌在安全性、貯藏、維持微環(huán)境菌群平衡等方面具有較大的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)首先對(duì)購(gòu)得的一株枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)鑒定,然后選取SPF昆明種小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物,設(shè)置高(1.0×10~8CFU/mL)、中(1.0×10~7CFU/mL)、低(1.0×10~6CFU/mL)劑量滅活菌組(IVC)和活菌對(duì)照組(VC)(1.0×10~7CFU/mL)、空白對(duì)照組(BC)分別灌服試驗(yàn)小鼠,研究熱滅活枯草芽孢桿菌對(duì)小鼠免疫指標(biāo)的影響,主要的試驗(yàn)結(jié)果如下:1.試驗(yàn)菌種的培養(yǎng)和鑒定。將購(gòu)得的試驗(yàn)菌種增殖培養(yǎng),制作細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。觀察菌落和菌體形態(tài)特征,測(cè)定細(xì)菌16S rDNA序列并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。結(jié)果顯示,試驗(yàn)菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間為10-14 h,其形態(tài)學(xué)觀察符合枯草芽孢桿菌形態(tài)學(xué)特點(diǎn);試驗(yàn)菌的16S rDNA擴(kuò)增序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus(ID:KY283146.1)序列相似度為100%,確定試驗(yàn)菌種為枯草芽孢桿菌。2.熱滅活枯草芽孢桿菌安全性評(píng)價(jià)。使用生化分析儀檢測(cè)各試驗(yàn)組血清ALT、BUN、CREA的含量。制作小腸組織切片,觀察各組小腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。結(jié)果顯示,各試驗(yàn)組和對(duì)照組血清生化指標(biāo)均無(wú)明顯的差異;低倍視野中各組小腸壁分層清晰,上皮黏膜結(jié)構(gòu)清晰,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),小腸絨毛結(jié)構(gòu)完整,固有層細(xì)胞排列緊密,這表明熱滅活枯草芽孢桿菌具有較高的安全性。3.熱滅活枯草芽孢桿菌對(duì)小鼠免疫指標(biāo)的影響。將40只小鼠隨機(jī)分為10組,按照0.3mL/只/d的劑量,試驗(yàn)組和活菌組分別灌服高、中、低劑量滅活枯草芽孢桿菌和中劑量活菌,空白對(duì)照組灌服LB肉湯,于灌服7 d和14 d后檢測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo):(1)小腸黏膜陽(yáng)性IgA細(xì)胞數(shù)和表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分。采用免疫組化法檢測(cè)各組小腸黏膜中陽(yáng)性IgA細(xì)胞數(shù)和表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示,灌胃7 d和14 d后IVC各組H-score評(píng)分均高于BC組,且以IVC中劑量組最高。這表明熱滅活枯草芽孢桿菌能增強(qiáng)小鼠機(jī)體腸道黏膜反應(yīng),以中劑量效果最顯著。(2)脾指數(shù)測(cè)定。稱量各組小鼠體重,常規(guī)眼球采血后處死小鼠,無(wú)菌取脾,記錄各組脾重量。結(jié)果顯示,灌胃7 d后,IVC中劑量組脾指數(shù)顯著高于其余各組(P0.05);灌胃14 d后,IVC各組脾指數(shù)均高于BC組,但差異不顯著(P0.05)。這表明熱滅活枯草芽孢桿菌能提高小鼠脾指數(shù),且以中劑量效果最顯著。(3)全血淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞含量測(cè)定。使用血球分析儀檢測(cè)各試驗(yàn)組全血樣本的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果顯示,灌胃7 d和14 d后,IVC中、高劑量組全血淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目均高于VC組和BC組,且IVC高劑量組顯著高于BC組(P0.05)。這表明熱滅活枯草芽孢桿菌能提高小鼠血液淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量,且高劑量效果最為顯著。(4)IL-2、IL-6、IFN-γ等血清細(xì)胞因子含量測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,灌胃7 d和14 d后,IVC各組血清細(xì)胞因子含量均高于BC組,且除IFN-γ外IVC高劑量組顯著高于BC組(P0.05)。這表明熱滅活枯草芽孢桿菌能顯著提高小鼠血清IL-2、IL-6、IFN-γ等3種細(xì)胞因子的含量,且在高劑量時(shí)效果顯著。(5)IL-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。使用RNA提取試劑盒提取總RNA,并其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后擴(kuò)增樣本cDNA,記錄體系中熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)(Ct值),并以β-Actin作為內(nèi)參校準(zhǔn)IL-2的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,灌胃7 d和14 d后,以BC組為準(zhǔn),IVC中、高劑量組IL-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均有所上調(diào),這與血清IL-2含量的檢測(cè)結(jié)果基本符合。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S859.797
【部分圖文】：

熱滅活枯草芽孢桿菌對(duì)小鼠免疫機(jī)能影響的研究分析菌種培養(yǎng)及鑒定菌種生長(zhǎng)曲線菌液波長(zhǎng) 600 nm 處的 OD 值，繪制生長(zhǎng)曲線（圖 1）。圖中顯示間為 10 -14 h。

試驗(yàn)菌菌體形態(tài)觀察（1000X）

圖 2 試驗(yàn)菌菌體形態(tài)觀察（1000X） 圖 3 試驗(yàn)菌菌落形態(tài)觀察ig 2 The observation of the test bacteria(1000X) Fig 3 The observation of colony morphology of the tes驗(yàn)菌種 16S rDNA 鑒定紫外光凝膠成像儀分析凝膠，與對(duì)照條帶相比，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約)。測(cè)序結(jié)果與 Genbank 中已知序列比對(duì)，與 Bacillus 標(biāo)準(zhǔn)菌株 (KY28 100%（圖 5），確定試驗(yàn)菌種為枯草芽孢桿菌。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊金霞;楊金彩;;益生菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞保護(hù)機(jī)制的研究進(jìn)展[J];世界華人消化雜志;2015年04期

2 朱豫萌;林姝;黨曉衛(wèi);王滿;李莉;孫榮青;陳香宇;;益生菌在重度急性胰腺炎治療中的作用[J];世界華人消化雜志;2014年32期

3 董懿櫻;陳臣;任婧;劉振民;;乳酸菌對(duì)腸免疫調(diào)節(jié)功能研究進(jìn)展[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2014年02期

4 李超;王春鳳;楊桂連;;乳酸菌胞外多糖腸道黏附及免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J];食品科學(xué);2014年11期

5 郭曉敏;楊桂連;王春鳳;;益生菌的免疫調(diào)節(jié)作用及其在腸道疾病治療中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

6 孫麗娜;孫晨鳴;趙勇;;免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的現(xiàn)狀及應(yīng)用[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2012年06期

7 王德純;;益生菌在各類食品中的應(yīng)用[J];中國(guó)食品工業(yè);2012年11期

8 郭夏麗;狄源寧;王巖;;枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J];中國(guó)土壤與肥料;2012年03期

9 楊俊琦;;枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能及免疫功能的影響[J];飼料廣角;2012年09期

10 潘娟;李利;劉麗媛;;益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用[J];畜牧與飼料科學(xué);2012年04期

本文編號(hào)：2818591