藍(lán)舌病(Bluetongue)是由藍(lán)舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一種嚴(yán)重侵害綿羊、牛和鹿等反芻動(dòng)物的、有蟲(chóng)媒傳播的急性非接觸性傳染病。近年來(lái)藍(lán)舌病在歐洲數(shù)次暴發(fā),引起了重大經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)將其列為必須申報(bào)的動(dòng)物傳染病。Viperin蛋白是2001年發(fā)現(xiàn)的一種干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs),能被多種病毒甚至細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá),并且已證實(shí)具有抑制病毒復(fù)制、免疫調(diào)節(jié)和代謝調(diào)節(jié)的功能。但是目前未見(jiàn)Viperin蛋白抑制BTV復(fù)制的相關(guān)報(bào)道。本研究利用RT-PCR方法從原代綿羊睪丸(PST)細(xì)胞和牛腎細(xì)胞(MDBK)中擴(kuò)增牛、羊Viperin基因,利用分子生物學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè),然后構(gòu)建真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后評(píng)價(jià)兩種Viperin蛋白在BTV復(fù)制過(guò)程中的作用。本實(shí)驗(yàn)首先利用實(shí)時(shí)定量PCR分析了BTV感染后Viperin基因轉(zhuǎn)錄水平的變化,結(jié)果顯示,BTV感染的PST、MDBK細(xì)胞以及綿羊血液中Viperin基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯升高。參考已公布的牛、羊Viperin mRNA序列設(shè)計(jì)引物,從BTV感染的PST和MDBK細(xì)胞中提取總RNA,RTPCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的條帶,將其與pMD18-T載體連接后進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果表明,牛、羊Viperin基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)均由1092對(duì)堿基組成。序列分析發(fā)現(xiàn),牛、羊Viperin蛋白與其它物種的Viperin結(jié)構(gòu)非常相似,均含有N末端、S-腺苷-L-甲硫氨酸(radical S-adenosyl methionine,SAM)和C末端結(jié)構(gòu)域,亮氨酸拉鏈(leucine zipper)和SAM結(jié)構(gòu)域中的基序序列高度保守。進(jìn)化樹(shù)分析表明,牛、羊Viperin與羊駝、野牦牛和藏羚羊等反芻動(dòng)物Viperin遺傳關(guān)系較近,與其它動(dòng)物Viperin的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。VP5是BTV外層衣殼的重要組成蛋白,具有膜滲透功能,介導(dǎo)病毒粒子從內(nèi)吞體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了VP5 N端缺少41個(gè)氨基酸的截短蛋白VP5?41aa在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)和純化,將其免疫新西蘭白兔后制備了多克隆抗體,Western blot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,該抗體不僅能與重組表達(dá)的VP5?41aa蛋白反應(yīng),而且能與BTV感染細(xì)胞中具有天然構(gòu)象的VP5蛋白反應(yīng),為后續(xù)評(píng)價(jià)病毒復(fù)制效率提供了重要的抗體檢測(cè)工具,也為深入研究VP5蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步研究牛、羊Viperin在BTV感染過(guò)程中的作用,將牛、羊Viperin基因亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建了帶有Flag標(biāo)簽的牛、羊Viperin基因真核表達(dá)質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,評(píng)價(jià)其對(duì)BTV復(fù)制效率的影響。結(jié)果顯示,牛、羊Viperin蛋白在BHK-21細(xì)胞中成功表達(dá),與對(duì)照組相比,表達(dá)牛、羊Viperin的細(xì)胞中,BTV結(jié)構(gòu)蛋白VP5、VP6以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1表達(dá)量明顯下降。實(shí)時(shí)定量PCR顯示,過(guò)表達(dá)Viperin蛋白可以有效降低BTV NS3mRNA的水平。蝕斑分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),牛、羊Viperin基因過(guò)表達(dá)明顯降低了病毒滴度。以上研究表明牛、羊Viperin均可有效抑制BTV的復(fù)制,在抗BTV感染的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

主要傳播媒介為庫(kù)蠓、虱、伊蚊等吸血昆蟲(chóng)(孫恩成,2014)，媒介昆蟲(chóng)一旦感染，終生帶毒（圖1.1），也有報(bào)道稱BTV可經(jīng)過(guò)胎盤(pán)垂直傳播給胎兒(Wilsonetal.,2009)。由于藍(lán)舌病可對(duì)畜牧業(yè)貿(mào)易造成重大威脅，OIE將其列為法定通報(bào)動(dòng)物疫病，在我國(guó)屬于一類動(dòng)物傳染病(林漢亮等，2008)。該病的主要臨床癥狀為稽留熱，口腔、腸道粘膜卡他性炎癥，病畜的典型癥狀為口舌、面部腫脹，甚至糜爛發(fā)紺，故稱作藍(lán)舌病。圖 1.1 藍(lán)舌病毒傳播示意圖以及可能的二次傳播途徑(Wilson et al., 2009)Figure 1.1 The transmission of bluetongue virus, showing putative secondary transmission routes(Wilson et al., 2009)早在18世紀(jì)，非洲大陸就有類似于BT癥狀的綿羊傳染病的記載，直到1905年

圖 1.2 BTV 粒子結(jié)構(gòu)蛋白和基因組分布示意圖.1.2 Schematic diagram of the structure of the BTV 色），內(nèi)層核心衣殼蛋白 VP7 和 VP3（綠色與紅色），核心色），基因組雙鏈 RNA（藍(lán)色）(Mertens et al., 2004 (purple and yellow), inner-coat VP7 and VP3(green and red), green), genomic double stranded RNA(blue)(Mertens et心蛋白 VP3 和 VP7 構(gòu)成，兩種蛋白都具3KDa）蛋白有兩種構(gòu)像，二者折疊方式不合體緊密結(jié)合在 VP3 分子下方，同時(shí)，白具有自組裝功能，因其在病毒組裝中的度保守(Tanaka et al., 1994)。VP7（38KD不同血清型的氨基酸序列同源性達(dá)到 90的 VP7 蛋白和針對(duì) VP7 蛋白的抗體為基同樣具有自組裝功能，VP3 和 VP7 蛋白在心樣顆粒（core-like particles，CLPs）(N

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引 言期蛋白，可在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中合成并形成微管樣結(jié)構(gòu)，NS1蛋白直接與BTV ssRNA 3'端UTR的ACUUAC六核苷酸片段作用，促進(jìn)其它病毒蛋白的合成，提高病毒滴度(Boyce et al., 2012)。NS2（42KDa）幾乎與NS1同時(shí)合成，可招募其它病毒蛋白形成病毒包涵體（Viral inclusion bodies，VIB），NS2具有多個(gè)特異結(jié)合ssRNA的位點(diǎn)和三磷酸核苷水解酶活性，在BTV十段RNA鏈的識(shí)別和組裝過(guò)程中起重要作用(Modrof et al., 2005)。 NS3（26KDa）和NS3a（24KDa）是BTV基因編碼的兩種膜蛋白，可增加宿主細(xì)胞膜的通透性以幫助BTV出芽，同時(shí)，在病毒的轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟中也發(fā)揮重要作用(Fengetal.,2013)。NS4（17KDa）通過(guò)抑制各種啟動(dòng)子的活性，阻礙宿主細(xì)胞干擾素（Interferon，IFN）mRNA的合成和干擾素刺激基因的表達(dá)，發(fā)揮免疫逃逸作用(Ratinier et al.,2016)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 魏鵬;孫恩成;劉霓紅;楊濤;徐青元;秦永麗;趙晶;馮瑜菲;王文世;張翠云;吳東來(lái);;抗藍(lán)舌病病毒VP6和VP7蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年05期

2 林漢亮;冉多良;王文;;藍(lán)舌病研究進(jìn)展[J];新疆畜牧業(yè);2008年01期

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1 呂爽;藍(lán)舌病病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用和機(jī)制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

2 方劍玉;Viperin蛋白抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制及其分子機(jī)制[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 李俊平;藍(lán)舌病病毒1型DNA疫苗及重組禽痘病毒載體疫苗的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

4 孫恩成;藍(lán)舌病防控技術(shù)的初步研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

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1 邢閃閃;藍(lán)舌病毒感染細(xì)胞（A.albopictus和PST）miRNA表達(dá)譜的鑒定與功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

2 呂建華;內(nèi)蒙古地區(qū)藍(lán)舌病流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)傳播媒介分布的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2817213