桿狀病毒(Baculovirus)是一種自然感染節(jié)肢動(dòng)物的有囊膜DNA病毒。桿狀病毒基因組可以容納高達(dá)38kb的外源基因片段插入,并且在合適的啟動(dòng)子控制下可以介導(dǎo)外源基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá),從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,而且桿狀病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)不能復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,具有良好的生物安全性;此外桿狀病毒可以刺激固有免疫系統(tǒng),具有良好的佐劑效果。因此,桿狀病毒具有成為一種理想的候選疫苗載體的潛力,目前已經(jīng)被應(yīng)用于多種動(dòng)物疾病的基因工程疫苗的研究。盡管具有以上優(yōu)點(diǎn),但是桿狀病毒系統(tǒng)存在的兩個(gè)主要缺陷嚴(yán)重限制了其大規(guī)模推廣應(yīng)用。首先,桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白的產(chǎn)量較低,導(dǎo)致了其生產(chǎn)動(dòng)物疫苗的成本居高不下,使得桿狀病毒基因工程疫苗的價(jià)格一直比較昂貴,嚴(yán)重制約了桿狀病毒基因工程疫苗在許多養(yǎng)殖場(chǎng)中的推廣應(yīng)用。其次,桿狀病毒很容易會(huì)被哺乳動(dòng)物血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)所清除,導(dǎo)致桿狀病毒載體疫苗在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的免疫時(shí)間和免疫效果都受到嚴(yán)重影響。因此,為了突破上述制約因素對(duì)桿狀病毒系統(tǒng)的限制,為研制出安全高效的新型桿狀病毒動(dòng)物疫苗提供科學(xué)依據(jù),本研究通過(guò)三個(gè)方面對(duì)桿狀病毒系統(tǒng)進(jìn)行了研究,并以豬瘟為動(dòng)物疾病病例探究了新型桿狀病毒載體疫苗的免疫效果,取得以下結(jié)果:1.本研究基于翻譯增強(qiáng)子調(diào)控蛋白表達(dá)的機(jī)理,選取3種翻譯增強(qiáng)子Syn21(一段21bp的富含AT的序列)、P10UTR(桿狀病毒P10基因的3’非編碼區(qū))和IVS(果蠅肌球蛋白的內(nèi)含子)對(duì)傳統(tǒng)的桿狀病毒載體進(jìn)行了優(yōu)化改造,并以GFP為報(bào)告基因檢驗(yàn)了三種翻譯增強(qiáng)子對(duì)外源蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示,Syn21可以增強(qiáng)GFP表達(dá)量4.04±0.12倍(n=3),P10UTR可以增強(qiáng)GFP表達(dá)量1.35±0.02倍(n=3),而IVS卻降低GFP表達(dá)量至對(duì)照載體的0.65±0.02(n=3)。同時(shí),進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)不同翻譯增強(qiáng)子之間具有明顯的協(xié)助增強(qiáng)作用,Syn21和P10UTR聯(lián)合使用時(shí)達(dá)到了最強(qiáng)的增強(qiáng)效果,可以增強(qiáng)GFP表達(dá)量4.80±0.08倍(n=3)。在這些研究的基礎(chǔ)上,本研究又檢驗(yàn)了Syn21和P10UTR聯(lián)合使用對(duì)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白(Cap)的增強(qiáng)效果。Western blotting和間接免疫熒光結(jié)果顯示Cap蛋白的產(chǎn)量得到了顯著提高,透射電鏡觀察結(jié)果表明Cap蛋白形成病毒樣顆粒的能力沒(méi)有受到影響,而且病毒樣顆粒的產(chǎn)量提高了4.09±0.04倍(n=3)。最后,又檢驗(yàn)了三種翻譯增強(qiáng)子對(duì)CMV啟動(dòng)子控制的基因表達(dá)的影響,同樣發(fā)現(xiàn)Syn21和P10UTR具有增強(qiáng)效果。因此,本研究使用翻譯增強(qiáng)子Syn21和P10UTR成功建立了一種高效的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),為以后動(dòng)物疾病亞單位疫苗和病毒樣顆粒疫苗的生產(chǎn)提供了有力的工具。2.根據(jù)Genebank上已經(jīng)發(fā)表的番茄叢矮病毒(TBSV)全基因序列,合成P19基因并將其克隆至組成型啟動(dòng)子opIE2的轉(zhuǎn)錄控制下,然后與GFP SiRNA共同轉(zhuǎn)染來(lái)檢驗(yàn)P19在Sf9昆蟲細(xì)胞中是否具有抑制RNA干擾的功能。結(jié)果顯示使用P19可以明顯抑制GFP SiRNA的功能,使GFP的表達(dá)量最高可恢復(fù)至正常的89.6%,而使用RNA干擾抑制功能喪失的P19突變體則沒(méi)有效果,這說(shuō)明P19在Sf9昆蟲細(xì)胞中可以有效的抑制RNA干擾。在這個(gè)研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步檢驗(yàn)瞬時(shí)表達(dá)P19對(duì)重組桿狀病毒的病毒增殖滴度和外源蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果表明病毒感染72h時(shí),瞬時(shí)表達(dá)P19可以顯著提高重組桿狀病毒的病毒增殖滴度6.80±0.08倍(n=3),可以提高GFP的表達(dá)量達(dá)1.81±0.04倍(n=3),提高螢火蟲熒光素酶的表達(dá)量達(dá)2.12±0.02倍(n=3)。進(jìn)一步分析P19不同表達(dá)時(shí)相對(duì)重組病毒的影響發(fā)現(xiàn),P19表達(dá)時(shí)相不同,重組病毒的增殖曲線有顯著差異,但是外源蛋白表達(dá)量之間沒(méi)有顯著差異。3.構(gòu)建桿狀病毒表面展示載體,然后用水泡性口炎病毒VSVG-ED對(duì)構(gòu)建的桿狀病毒表面展示載體進(jìn)行假型化修飾,同時(shí)將合成的4個(gè)補(bǔ)體抑制劑基因克隆至假型化修飾后的桿狀病毒表面展示載體中,然后構(gòu)建新的重組病毒。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示補(bǔ)體抑制劑已經(jīng)成功展示于Sf9昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞膜。用小鼠和仔豬的血清處理重組病毒發(fā)現(xiàn),表面展示OMCI、pFc和DAF的重組桿狀病毒對(duì)小鼠血清滅活的抵抗力得到顯著提高,存活率分別達(dá)到了39.3%、65.6%和90.2%,而對(duì)照病毒只有9.4%;表面展示pFc、OMCI和SPICE的重組桿狀病毒對(duì)豬血清滅活的抵抗力得到顯著提高,存活率分別達(dá)到了75.6%、42.3%和36.5%,對(duì)照病毒只有10.2%。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明展示補(bǔ)體抑制劑的假型化修飾重組桿狀病毒可以獲得對(duì)血清補(bǔ)體滅活的抵抗能力,其中表面展示DAF的假型化修飾重組病毒對(duì)小鼠血清補(bǔ)體抵抗能力最強(qiáng),而表面展示pFc的假型化修飾重組病毒對(duì)豬血清補(bǔ)體抵抗能力最強(qiáng),為以后開(kāi)發(fā)具有拮抗補(bǔ)體滅活能力的高效桿狀病毒載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。4.綜合前幾章研究,以豬瘟病毒為例初步探究了利用新型桿狀病毒系統(tǒng)構(gòu)建的豬瘟疫苗的免疫效果。首先PCR擴(kuò)增獲得豬瘟病毒E2基因序列并克隆至新型桿狀病毒載體中,然后構(gòu)建重組病毒并免疫健康仔豬。試驗(yàn)結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)的重組桿狀病毒相比,本研究構(gòu)建的新型桿狀病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了更高水平的豬瘟特異性抗體、中和抗體以及IFN-γ,這說(shuō)明新型桿狀病毒系統(tǒng)作為動(dòng)物疫苗載體具有明顯的優(yōu)勢(shì),為下一步豬瘟桿狀病毒載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ),也為利用桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)其它動(dòng)物疫苗的研究提供了新的工具和平臺(tái)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖 1-1 桿狀病毒的兩種病毒粒子形態(tài)（引自 van Oers 2011）Fig. 1-1 Two virion types of Baculovirus毒主要感染膜翅目，雙翅目和鱗翅目昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物，迄今為狀病毒。截止到 2014 年，GeneBank 上總共發(fā)表了 67 個(gè)不同桿

允許第二個(gè)開(kāi)放性閱讀框以 Cap 非依賴性的方式進(jìn)行翻譯。當(dāng) EGFP 與 GP64 共同插入 AcBac GP64 bacmid 時(shí)，EGFP 的表達(dá)量經(jīng)多次傳代后依然可以維持較高的水平。圖1-2 基因組和轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性。桿狀病毒在昆蟲離體細(xì)胞傳代過(guò)程中BV的滴度和重組蛋白（GFP）下降(A)。同時(shí)缺損干擾顆粒（DIP）大量聚集，這些DIP大小比正常的BV要小(B)。BV滴度用TCID50units/mL表示。（引自Pijlman et al. 2006）Fig. 1-2 Tailoring of genome and transgene stability. During passaging of baculoviruses in cultured16

圖 1-3 無(wú)病毒粒子污染的新的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的新方法（引自 Marek et al. 2011）Fig. 1-3 A novel baculovirus insect cell technology approach designated for the production of proteinsfree of contaminating baculoviral virions1.7 結(jié)論

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本文編號(hào)：2817117