本文關(guān)鍵詞：抗犬瘟熱病毒中藥化學(xué)成分篩選及異綠原酸A對MDCK細(xì)胞TLR3信號通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種傳染性和多系統(tǒng)性的病毒性疾病,影響家養(yǎng)和野生犬科動物以及其它陸地和水生食肉動物的健康,盡管該疾病在一定程度上由疫苗接種得以控制,但是已接種疫苗的動物也時常有該疾病的發(fā)生,因此使用藥物進(jìn)行治療發(fā)病動物是重要的彌補(bǔ)措施。作為天然藥物的重要組成部分,中藥具有廣泛的抗病毒活性,其抗病毒研究主要從中藥化學(xué)成分、單味中藥和中藥復(fù)方制劑三個方面進(jìn)行,篩選有效的中藥化學(xué)成分已成為當(dāng)前抗病毒新藥研發(fā)的一個熱點(diǎn)。本研究選擇了蟲草素、丹皮酚、橄欖苦苷、梓醇、根皮素、芍藥苷、迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸、異綠原酸A、蓮心堿、紫草素、芹菜素13種中藥化學(xué)成分,進(jìn)行抗CDV活性篩選。CDV屬于副粘液病毒科麻疹病毒屬成員,其負(fù)極性非分段的單鏈RNA基因組由脂質(zhì)膜所包裹,該基因組在其復(fù)制增殖過程中會產(chǎn)生ds RNA分子,TLR3可識別ds RNA進(jìn)而激活炎癥通路和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,因此前炎癥性因子及輔助刺激分子得以釋放,調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫防御或者加重機(jī)體細(xì)胞的炎癥反應(yīng),因而從TLR 3信號通路研究中藥化學(xué)成分抗CDV作用具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值,因此本研究進(jìn)一步探討異綠原酸A對狗腎細(xì)胞(MDCK)TLR3信號通路的影響。為了更好的評價(jià)所篩選藥物對CDV的作用,首先對Gen Bank提交的CDV核衣殼蛋白(NP)基因序列進(jìn)行分析對比,設(shè)計(jì)多株犬瘟熱病毒的通用引物和Taq Man通用探針,建立一種以體外轉(zhuǎn)錄RNA為標(biāo)準(zhǔn)品的一步法熒光定量PCR檢測方法,用于檢測CDV核酸的變化。所建立的CDV熒光定量PCR檢測方法靈敏度可達(dá)4.02個拷貝/μL,比普通RT-PCR方法的靈敏度高出100倍。對犬細(xì)小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠狀病毒(CCV)、犬副流感病毒(CP IV)核酸檢測為陰性,具有很好的特異性。采用CCK-8法分別檢測了13種中藥化學(xué)成分對Vero細(xì)胞的毒性作用,從而確定了半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)。使用100TCID50病毒同時作用于Vero細(xì)胞2 h后洗去病毒上清,將不同劑量的候選中藥化學(xué)成分加入,依據(jù)CPE法測定了中藥化學(xué)成分的抗病毒作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸、異綠原酸A對CDV體外的最大抑制率(MIR)均大于75%,治療指數(shù)(TI)均大于4。使用一步法熒光定量PCR檢測其治療后的核酸均顯著低于未治療組,表明這幾種藥物可顯著在體外抑制CDV增殖。進(jìn)一步研究這幾種藥物對病毒的預(yù)防作用和直接滅活作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾種藥物并沒有顯著的直接滅活病毒作用和預(yù)防病毒感染作用。選擇異綠原酸A作為所篩選抗病毒藥物的代表,研究其對MDCK細(xì)胞感染CDV后TLR3及相關(guān)基因表達(dá)的影響,并測定了其對IFN-β分泌量的影響;結(jié)果表明50μg/ml、75μg/ml的藥物對IL-Iβ、IL-6、TNF-α、TLR3基因轉(zhuǎn)錄水平均有顯著的下調(diào)作用,但對IFN-β的分泌量影響不顯著。綜上所述,迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸、異綠原酸A四種藥物在體外對犬瘟熱病毒感染具有治療作用,但沒有明顯的滅活病毒作用和預(yù)防病毒感染作用;異綠原酸A可以通過影響TLR3信號通路發(fā)揮抗犬瘟熱病毒感染MDCK細(xì)胞的作用;這些結(jié)果表明,迷迭香酸、咖啡酸、菊苣酸,異綠原酸A可以作為潛在抗犬瘟熱病毒的物質(zhì)。
【關(guān)鍵詞】：一步法熒光定量PCR 抗犬瘟熱病毒 異綠原酸A TLR3
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-13
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述13-27
• 第一章 13種中藥化學(xué)成分研究進(jìn)展13-22
• 1.1 咖啡酸、迷迭香酸、菊苣酸、異綠原酸A研究進(jìn)展13-16
• 1.2 蟲草素研究進(jìn)展16
• 1.3 丹皮酚研究進(jìn)展16-17
• 1.4 芍藥苷研究進(jìn)展17
• 1.5 梓醇研究進(jìn)展17-18
• 1.6 其它藥物研究進(jìn)展18-22
• 第二章 犬瘟熱病防治研究進(jìn)展22-27
• 2.1 病原學(xué)特征22-23
• 2.2 犬瘟熱病毒對TLR3的影響23
• 2.3 犬瘟熱的發(fā)病機(jī)理23
• 2.4 犬瘟熱的防控23-25
• 2.5 犬瘟熱的治療25-27
• 第二篇 研究內(nèi)容27-65
• 第一章 犬瘟熱病毒一步法熒光定量PCR檢測方法的建立27-38
• 1.1 材料27-29
• 1.2 方法29-32
• 1.3 結(jié)果32-36
• 1.4 討論36-37
• 1.5 小結(jié)37-38
• 第二章 抗犬瘟熱病毒活性中藥化學(xué)成分篩選38-50
• 2.1 材料38-39
• 2.2 方法39-42
• 2.3 結(jié)果42-48
• 2.4 討論48-49
• 2.5 小結(jié)49-50
• 第三章 異綠原酸A對MDCK細(xì)胞TLR3信號通路的影響50-65
• 3.1 材料50-51
• 3.2 方法51-56
• 3.3 結(jié)果56-62
• 3.4 討論62-64
• 3.5 小結(jié)64-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-79
• 導(dǎo)師簡介79-80
• 作者簡介80-81
• 致謝81

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：抗犬瘟熱病毒中藥化學(xué)成分篩選及異綠原酸A對MDCK細(xì)胞TLR3信號通路的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：281699