在雌性動(dòng)物中,抗繆勒氏管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)主要由腔前卵泡及小有腔卵泡分泌,能抑制原始卵泡的募集以及初級(jí)卵泡向有腔卵泡的轉(zhuǎn)換。抑制素(Inhibin,INH)主要由大有腔卵泡分泌,其對(duì)有腔卵泡的發(fā)育以及成熟具有抑制作用。AMH和INH同屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族成員,且兩者都對(duì)卵泡發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用,然而兩者間是否存在相互作用或協(xié)同作用尚不明晰。因此,本研究一方面從細(xì)胞水平分析AMH與抑制素A(Inhibin A,INHA)對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌的調(diào)控作用與機(jī)制,另一方面利用基因免疫技術(shù)從活體水平探討了AMH與INH聯(lián)合免疫對(duì)小鼠血漿類固醇激素含量、卵巢重量及產(chǎn)仔數(shù)的影響。旨在闡明AMH與INH兩者在卵泡發(fā)育過(guò)程中的相互作用,本研究不僅有助于豐富動(dòng)物繁殖內(nèi)分泌理論,同時(shí)為開(kāi)發(fā)提高動(dòng)物繁殖力的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.AMH和INHA單獨(dú)處理對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成與分泌的調(diào)控作用分別將不同濃度(1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)AMH或INHA在基礎(chǔ)水平或FSH誘導(dǎo)水平處理小鼠顆粒細(xì)胞48 h,利用ELISA法檢測(cè)顆粒細(xì)胞上清液中雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的分泌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單獨(dú)添加AMH對(duì)基礎(chǔ)水平E_2和P_4的生成無(wú)顯著影響;INHA對(duì)基礎(chǔ)水平E_2的生成也沒(méi)有顯著影響,但低劑量(1ng/mL)和中劑量(10 ng/mL)INHA處理組對(duì)基礎(chǔ)水平孕酮的生成有顯著抑制作用(P0.05);值得注意地是,AMH和INHA均能極顯著抑制FSH誘導(dǎo)水平下E_2和P_4的合成(P0.01)。采用Real-time PCR法檢測(cè)顆粒細(xì)胞芳香化酶相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)AMH和INHA均不改變基礎(chǔ)水平下CYP19A1、FSHR、P450scc、3βHSD和StAR mRNA的表達(dá),但均能極顯著抑制FSH誘導(dǎo)水平下CYP19A1、FSHR、P450scc、3βHSD和StAR mRNA的表達(dá)(P0.01)。2.AMH和INHA聯(lián)合處理對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素合成與分泌的調(diào)控作用與機(jī)制研究將AMH和INHA聯(lián)合添加于小鼠顆粒細(xì)胞48 h后,檢測(cè)上清中雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與AMH或INHA的單獨(dú)添加組相比,AMH和INHA聯(lián)合添加能極顯著抑制FSH誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞中E_2的分泌(P0.01);此外,AMH和INHA聯(lián)合添加對(duì)FSH誘導(dǎo)孕酮分泌的抑制作用極顯著強(qiáng)于AMH單獨(dú)添加組(P0.01),顯著強(qiáng)于INHA單獨(dú)添加組(P0.05),提示AMH與INHA可協(xié)同負(fù)調(diào)控FSH誘導(dǎo)水平下雌激素和孕酮的分泌。此外,AMH和INHA均能顯著抑制FSH誘導(dǎo)的胞內(nèi)cAMP水平(P0.05)以及CREB磷酸化;FSH還能誘導(dǎo)INH-Activin競(jìng)爭(zhēng)系統(tǒng)下游Smad2/3的磷酸化(P0.01),而INHA則能抑制FSH介導(dǎo)的pSmad2/3信號(hào)通路(P0.05)。結(jié)果提示,AMH和INH主要通過(guò)抑制FSH介導(dǎo)的cAMP-PKA-CREB信號(hào)通路而發(fā)揮其對(duì)類固醇激素的負(fù)調(diào)控作用;INH還可通過(guò)抑制Smad2/3信號(hào)通路抑制類固醇激素的生成。3.AMH和INH聯(lián)合免疫對(duì)小鼠繁殖力的影響選取120只體重相近的5周齡昆明雌鼠,隨機(jī)分為4組,分別單獨(dú)肌肉注射pVAX-tPA-SAMH-asd(A組)與pVAX-tPA-SINH-asd(I組)質(zhì)粒以及聯(lián)合注射pVAX-tPA-SAMH-asd和pVAX-tPA-SINH-asd質(zhì)粒(AI組),生理鹽水作為對(duì)照組(C組),間隔2周后相同劑量加強(qiáng)免疫1次。結(jié)果表明,不同質(zhì)粒免疫組均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)AMH或(和)INH特異性免疫反應(yīng),且具有很高的抗體陽(yáng)性率和抗體滴度;其中,INH抗體陽(yáng)性鼠與AMH和INH雙抗體陽(yáng)性鼠血漿中雌二醇水平以及卵巢重量均顯著高于對(duì)照組(P0.05);AMH抗體陽(yáng)性鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著高于抗體陰性鼠(14.88±2.16 VS.13.43±2.28,P0.05),AMH和INH雙抗體陽(yáng)性鼠的產(chǎn)仔數(shù)極顯著(15.61±1.79 VS.13.43±2.28,P0.01)高于陰性鼠。此外,研究發(fā)現(xiàn)疫苗免疫后不會(huì)影響小鼠的體增重和臟器指數(shù)。綜上所述,AMH與INHA能協(xié)同抑制顆粒細(xì)胞類固醇激素的合成與分泌,AMH與INHA聯(lián)合基因免疫能顯著提高小鼠繁殖力。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S814
【部分圖文】：

圖 1-1 不同激素和因子在卵泡生長(zhǎng)中的作用（改自 Hillier 2009 和 Visser 2006）Fig. 1-1 The role of different hormones and factors in follicular growth (changed from Hillier2009 and Visser 2006)1.3 INH 的生物學(xué)特性與功能1.3.1 INH 的結(jié)構(gòu)與表達(dá)INH 屬于 TGF-β 超家族，是由兩個(gè)亞基組成的 32 kDa 的異源二聚體糖蛋白，α-亞基（18 kDa）和 β-亞基（14 kDa）βA 或 βB 形成抑制素 A（α-βA）和抑制素 B（α-βB）(Ardekani et al 1998, Geng et al 2008, Ling et al 1986, Mason et al 1985)。由兩個(gè) β-亞基組成的 24 kDa 同源二聚體，形成激活素 A（βA-βA），激活素 B（βB-βB）和激活素 AB（βA-βB）(Ling et al 1986, M’Baye et al 2015)，如圖 1-2 所示。INH α、βA、βB 亞基 mRNA 在綿羊的大優(yōu)勢(shì)卵泡中的表達(dá)顯著高于小卵泡(Campbell and Baird 2001)；豬大卵泡中卵母細(xì)胞 INH βA 和 βB 亞基蛋白表達(dá)量也顯

圖1-2 Inhibin和Activin的基本分子結(jié)構(gòu)（Knight 2001）g. 1-2 The basic molecular structure of Inhibin and Activin (Knight 2類固醇生成強(qiáng) LH 對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞雄激素生物合成的刺激作用，但 Actsueh AJ et al 1987)；其可作用于人卵巢鞘樣腫瘤細(xì)胞，提高和雄激素合成(Sawetawan C et al 1996)，同時(shí)也能消除了激中 StAR 和 3β-HSD 表達(dá)及雄激素生成的抑制作用(Young an無(wú)論在活體水平還是細(xì)胞水平，抑制素在顆粒細(xì)胞類固醇生可：已經(jīng)報(bào)道了抑制素對(duì)大鼠顆粒細(xì)胞 FSH 誘導(dǎo)的雌二醇產(chǎn)009, Ying SY et al 1986)；用 Inhibin α 抗體處理后，也顯著增分泌和細(xì)胞增殖(Cai et al 2015)；而與之相反的是，體內(nèi)免疫ibin 導(dǎo)致雌二醇分泌顯著降低，孕酮水平顯著升高，當(dāng)提供

中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文sd 真核表達(dá)質(zhì)粒由王亞平構(gòu)建與保存（王AX-tPA-SAMH-asd 真核表達(dá)質(zhì)粒由姜婷圖 2-2 所示；小鼠原代顆粒細(xì)胞取自 21

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