雙酚A(Bisphenol A,BPA)屬于環(huán)境干擾物,作為增塑劑被應用于初生兒使用的一切塑料制品及各種食品內(nèi)涂層。因為BPA的化學結(jié)構(gòu)與雌激素類似,因此具有抗雄激素的活性。菟絲子黃酮作為傳統(tǒng)補腎中藥菟絲子的主要有效成分,不僅具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化的作用,而且還能改善生殖器官的功能。本試驗通過觀察菟絲子黃酮對雙酚A致小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的緩解作用,闡述菟絲子黃酮緩解BPA生殖毒性的作用機制。體內(nèi)試驗:將60只昆明雄性小鼠隨機均分為5組,即陰性對照組,BPA模型組和菟絲子黃酮低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(30 mg/kg)劑量保護組。模型組每天灌服20mg/kg的BPA,保護組同時灌服相應劑量的菟絲子黃酮和BP A(20mg/kg),1次/d,連用7 d,7 d末眼球采血,處死。分離血樣,放免法檢測血清中睪酮和促黃體生成素的含量,同時制作睪丸切片、光鏡檢測精子活力、睪丸間質(zhì)細胞染色定位及純度分析。TUNEL法檢測凋亡小體的數(shù)量,Real-Time Q PCR檢測睪丸組織中間質(zhì)細胞中MAPK通路上ERK、P38和JNK的轉(zhuǎn)錄水平,Western Blotting檢測MAPK通路蛋白磷酸化的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,20mg/kg的BPA可極顯著降低小鼠血清中睪酮和黃體生成素含量(P0.01);與模型組相比,10、20、30 mg/kg的菟絲子黃酮組能極顯著提高血清中黃體生成素的含量(P0.01);30 mg/kg的菟絲子黃酮能極顯著提高血清中睪酮的含量(P0.01)。與空白對照組相比,模型組的ERK的mRNA的表達量顯著降低(P0.05),P38和JNK的mRNA表達量顯著上調(diào)(P0.05);與模型組相比,10、20、30 mg/kg的菟絲子黃酮組顯著上調(diào)了ERK的mRNA的表達量(P0.05),P38和JNK的mRNA表達量顯著下調(diào)(P0.05)。與陰性對照組相比,模型組中睪丸間質(zhì)細胞數(shù)量以及精子的數(shù)量顯著減少(P0.05);與模型組相比,10、20、30 mg/kg的菟絲子黃酮組的睪丸間質(zhì)細胞數(shù)量以及精子的數(shù)量顯著增加(P0.05)。精子畸形率會隨菟絲子黃酮的濃度的升高而顯著降低(P0.05)。TUNEL法檢測模型組睪丸間質(zhì)細胞的凋亡數(shù)量顯著高于陰性對照組(P0.05)。與陰性對照組相比,BPA模型組的睪丸間質(zhì)細胞ERK蛋白磷酸化極顯著降低(P0.01);P38和JNK蛋白磷酸化極顯著增加(P0.01);與模型組相比,各個劑量組的菟絲子黃酮能極顯著提高睪丸間質(zhì)細胞ERK蛋白磷酸化的表達(P0.01),同時抑制JNK和P-38蛋白磷酸化的表達(P0.01)。高、中、低劑量的菟絲子黃酮均可顯著緩解上述指標的異常(P0.05或P0.01),且緩解作用與濃度呈正相關。體外試驗:以生長狀態(tài)良好,且處于對數(shù)生長期的小鼠睪丸間質(zhì)細胞為對象,利用MTT法篩選確定BPA對小鼠睪丸間質(zhì)細胞的最適染毒劑量和菟絲子黃酮對該細胞的安全劑量范圍。本試驗中用一定劑量的菟絲子黃酮預處理細胞4 h,BPA染毒細胞24 h后,通過放免法檢測細胞睪酮和促黃體生成素的分泌量,TU NEL法檢測凋亡小體的數(shù)量,Real-time PCR檢測BPA誘導的小鼠睪丸間質(zhì)細胞中MAPK通路上的ERK、P38和JNK的轉(zhuǎn)錄水平。Western Blotting檢測MAPK(絲裂原蛋白激酶)通路蛋白磷酸化的表達。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,80μmoL/mL的BPA顯著降低睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮和促黃體生成素的分泌量(P0.05)。與模型組相比,250、300、350、400μg/mL的菟絲子黃酮組顯著提高睪酮和黃體生成素的含量(P0.05)。TUNEL法檢測到模型組的凋亡小體的數(shù)量顯著高于空白對照組(P0.05);與模型組相比,不同濃度的菟絲子黃酮均能顯著減少凋亡小體的數(shù)量(P0.05)。與空白對照組相比,模型組的ERK的mR NA的表達量顯著降低(P0.05),P38和JNK的mRNA表達量顯著上調(diào)(P0.05);與模型組相比,250、300、350、400μg/mL的菟絲子黃酮組顯著上調(diào)了E RK的mRNA的表達量(P0.05),P38和JNK的mRNA表達量顯著下調(diào)(P0.05)。與空白對照組相比,BPA模型組的睪丸間質(zhì)細胞ERK蛋白磷酸化極顯著降低(P0.01);P38和JNK蛋白磷酸化極顯著增加(P0.01);與模型組相比,菟絲子黃酮能極顯著提高睪丸間質(zhì)細胞ERK蛋白磷酸化的表達(P0.01),同時抑制JNK和P-38蛋白磷酸化的表達(P0.01)。250、300、350、400μg/mL的菟絲子黃酮均可顯著緩解上述指標的異常(P0.05或P0.01),且緩解作用與濃度呈正相關。綜上所述,菟絲子黃酮可以通過MAPK通路緩解BPA加速睪丸間質(zhì)細胞凋亡,減少BPA對睪丸間質(zhì)細胞的損傷,緩解激素的分泌異常。
【學位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S859.8
【部分圖文】：

3 結(jié)果3.1 菟絲子黃酮對 BPA 致小鼠睪丸組織病理學變化的影響光鏡下觀察結(jié)果顯示，對照組小鼠睪丸曲精細管細胞排列整齊，橫斷面呈圓形或橢圓形，各級生精細胞按次序排列在管壁上，結(jié)構(gòu)清晰，管腔內(nèi)可見大量的未成熟各級細胞，間質(zhì)細胞均勻的分布在基膜外，排列整齊（圖 A）。20 mg/kg BPA 染毒組，部分生精小管萎縮，各級生精細胞排列紊亂、脫落，生精細胞層減少，管腔間隙變大，精子數(shù)量明顯減少，睪丸間質(zhì)細胞較對照組明顯減少（圖 B）。10 mg/kg 菟絲子黃酮劑量保護組，生精細胞層對比 BPA 組，開始增多，管腔間隙無明顯變化，生精細胞排列較規(guī)律，精子細胞無明顯變化，睪丸間質(zhì)細胞分布較為均勻（圖 C），20 mg/kg菟絲子黃酮劑量保護組，生精小管逐漸恢復，生精細胞排列比較規(guī)律，無明顯脫落，管腔間隙變小，精子細胞明顯增多，睪丸間質(zhì)細胞分布較為均勻（圖 D），30 mg/kg菟絲子黃酮劑量保護組對比 BPA 組，生精小管趨于對照組，生精細胞排列規(guī)律排列在管壁上，層次清晰，管腔內(nèi)可見大量的未成熟的精子細胞，間質(zhì)細胞均勻分布在基膜外。見圖 1

圖 2 菟絲子黃酮對 BPA 染毒小鼠精子畸形率的影響Fig. 2 Effect of Cuscuta chinensis flavonoids on the deformity rate of mice induced by BPA注：A：空白對照組 B：雙酚 A 模型組 C：10mg/kg 菟絲子黃酮組 D: 20mg/kg 菟絲子黃酮組 E: 30mg/kg 菟絲子黃酮組Note: A: Blank control group B: BPA Model group C:10mg/kg Cuscuta chinensis flavonoids group D:20mg/kg Cuscuta chinensis flavonoidsgroup E:30mg/kg Cuscuta chinensis flavonoids GroupA B C D E050100150*組組精精精

空白組 12 15.12±0.43C0.06±0.02BBPA 組 12 12.43±0.44A0.03±0.01A10mg/kg 菟絲子黃酮組 12 13.62±0.46B0.03±0.01A20mg/kg 菟絲子黃酮組 12 14.9±0.49BC0.04±0.03AB30mg/kg 菟絲子黃酮組 12 15.56±0.21C0.06±0.01B注：含不同大寫字母表示差異極顯著（p<0.01）Note: The different uppercase letters indicate that the difference is extremely significant (p<0.01)3.5 菟絲子黃酮對 BPA 染毒小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的影響如圖 4、圖 5 所示，由小鼠睪丸中提取的睪丸間質(zhì)細胞經(jīng) TUNEL 法檢測凋亡，檢測到呈綠色熒光的凋亡細胞，且陽性染色明亮，各組之間整體比較具有顯著差異（P<0.05），其中以雙酚 A 組細胞凋亡率最高，其次是 10 mg/kg 菟絲子黃酮保護組、20mg/kg 菟絲子黃酮保護組、30 mg/mL 菟絲子黃酮保護組，空白組最低。菟絲子黃酮能調(diào)節(jié)雙酚 A 對間質(zhì)細胞凋亡，起到減輕雙酚 A 毒性的作用。基于樣本數(shù)量較少及作用時間單一，藥物對細胞凋亡的影響需要進一步研究。

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本文編號：2815162