小鵝瘟是一種高發(fā)病率和高死亡率的傳染病,給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大危害。目前小鵝瘟病尚無有效的治療藥物,主要依靠卵黃抗體(Immunoglobulin of yolk,IgY)和高免血清等進行防治,所以新型藥物的研制具有重要意義。干擾素(IFN)是體內(nèi)一種重要的干擾病毒繁殖的免疫活性細胞因子,主要由病毒、噬菌體及人工合成核苷酸(如聚肌胞)誘生,具有廣譜的抗病毒活性,對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用,還具有抗增殖,抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)細胞反應的功能。本研究將鵝干擾素α(goIFNα)克隆至大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pSIP409-pgsA’中,并將其電轉化至植物乳桿菌NC8中獲得具有抗病毒效果的新功能型乳酸菌,本研究對制備抗病毒新型微生態(tài)制劑防治小鵝瘟病以及確保動物的生產(chǎn)安全與食品安全具有重要意義。具體研究方案與結果如下:根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子對GenBank上已發(fā)表的鵝IFNα序列基因進行優(yōu)化,通過生物公司合成后,將goIFNα片段與原核表達載體pET28-a連接,成功構建了原核表達質(zhì)粒pET28-a-goIFNα,并將質(zhì)粒轉入到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,經(jīng)過IPTG誘導后進行SDS-PAGE和Western-blot檢測。SDS-PAGE和Western-blot的鑒定結果表明,goIFNα蛋白分子量大小在18kd左右,與預期大小相同,同時具有良好的反應原性。通過切膠回收的方法將目的條帶回收,將蛋白膠碾碎后與PBS混合后,將其打入小鼠體內(nèi),15天后回收血清。Western-blot的鑒定結果表明成功制作鼠抗goIFNα血清。根據(jù)GenBank上已公布的鵝IFNα序列在其完整的開放閱讀框上下游設計上、下游引物,并分別在上游引物和下游引物中加入XbaⅠ和HindⅢ酶切位點。以質(zhì)粒pMD18-T-goIFNα為模板PCR擴增,獲得goIFNα基因片段并與大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pSIP409-pgsA’連接,構建穿梭表達質(zhì)粒pSIP409-pgsA’-goIFNα。經(jīng)電轉化至植物乳桿菌NC8中,構建新功能型乳酸菌NC8-pSIP409-pgsA’-goIFNα(以下縮寫為pp-goIFNα/NC8)。提質(zhì)粒后進行PCR、雙酶切驗證,并將質(zhì)粒測序。驗證結果均證明成功構建新功能型乳酸菌。新功能型乳酸菌經(jīng)清酒乳桿菌素sakasin-P(SppIP)誘導后超聲破碎和反復凍融,經(jīng)Western-blot分析,結果表明新功能型乳酸菌已表達goIFNα蛋白,通過免疫熒光試驗也證明了goIFNα錨定表達在菌體表面具有良好的反應原性。通過鵝胚成纖維細胞(GEF)對新功能型乳酸菌的抗病毒效果進行體外檢測。首先測定不同濃度(10:1、80:1、160:1)的新功能型乳酸菌的抗病毒效果,新功能型乳酸菌與細胞之間濃度比為80:1時抗病毒效果最佳。隨后將新功能型乳酸菌以80:1的比例孵育細胞,設置DMEM空白對照,GPV對照,干擾素蛋白對照,NC8空載體(NC8pSIP409-pgsA’,pp/NC8)組,pp-goIFNα/NC8+GPV組(即先加入新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8后加入小鵝瘟病毒GPV),GPV+pp-goIFNα/NC8組(即先加入小鵝瘟病毒GPV后加入新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8)。結果顯示,與空載體組相比,pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及蛋白組均有良好的抗病毒作用。除此之外我們還測定了細胞抗病毒因子goIFNα和goIFN-β以及干擾素刺激因子MX、OAS和PKR基因的相對表達量,結果顯示,與空載體組相比,pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及蛋白均能夠上調(diào)GEF的goIFNα和goIFN-β基因表達水平,由此上調(diào)細胞內(nèi)干擾素刺激基因(ISG)的mRNA水平,保護細胞不受小鵝瘟病毒的感染。將新功能型乳酸菌在3日齡雛鵝連續(xù)口服3天,第4天對雛鵝攻毒,同時記錄體重,計算體重變化率和生存情況。免疫結束后取組織進行相關指標的檢測。取血清測定抗病毒因子IFNα和IFN-β在外周血中的水平,取脾臟檢測組織中細胞抗病毒因子goIFNα和goIFN-β以及干擾素刺激因子MX、OAS和PKR基因的基因表達量。取肝臟、心臟、脾臟和腸道制作病理切片觀察組織病理學變化。結果顯示,攻毒后Normal組、GPV組、pp/NC8+GPV組、pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及IgY組雛鵝的存活率分別為100%,30%,40%,50%,70%和40%。提取脾臟中病毒DNA和總RNA后檢測,結果顯示,與對照組相比,新功能型乳酸菌pp/NC8-goIFNα可以顯著降低GPV的DNA基因表達量,提升雛鵝脾臟中IFNα和IFN-β基因表達水平,由此上調(diào)各種抗病毒細胞因子如MX、OAS、PKR等。通過肝臟、心臟、脾臟和小腸的組織病理切片可觀察到,GPV組雛鵝組織病理學變化最嚴重,pp-goIFNα/NC8+GPV組、GPV+pp-goIFNα/NC8組以及IgY組雛鵝未見明顯組織病理學變化。綜上所述,本實驗成功制備鼠抗goIFNα血清,成功構建新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8,并成功將goIFNα蛋白錨定在乳酸菌表面,結果顯示新功能型乳酸菌能夠降低組織病理損傷和炎性病變,降低體內(nèi)病毒的復制,增加了機體的抗病毒效果,為研制治療小鵝瘟病的生物制品具有重要意義。
【學位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S858.33
【部分圖文】：

圖 1.1 goIFN-α 基因 PCR 擴增M. DL-2 000 Marker. 1. PCR 擴sult of PCR amplification produc2 000 Marker. 1.Amplification p50007505002501002000150010003000M 1bp

8-a-IFNα 的構建圖 1.2 克隆質(zhì)粒 pMD19T-goIFN-α L-5 000 Marker. 1,2. NdeⅠ+ XhoⅠ enzyme digestion analysis of the clon0 Marker. 1,2. NdeⅠ+ XhoⅠ double dig

白的 Western-blot 分析圖 1.4 goIFN-α 蛋白的 Western-blot 檢測M. 蛋白質(zhì) Marker. 1. pET28-a/BL21 對照. 2-9.蛋白 goIFN-αFig.1.4 Western-blot analysis of goIFN-α proteinM. Protein Marker. 1. pET28-a/BL21 control. 2-9. goIFN-α protein0

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