鎳(Ni)廣泛存于自然界,因其具有良好的物理和化學(xué)特性,常被用于化學(xué)工業(yè)。鎳和鎳化合物的廣泛分布和應(yīng)用增加了人和動(dòng)植物接觸的可能性。由于工業(yè)三廢處理的不完善和不徹底,廢舊電池等環(huán)境污染處理不恰當(dāng),導(dǎo)致環(huán)境中的鎳污染物日益增加。鎳已被確定為是一種具有毒性和致癌性的重金屬。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量的鎳能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及壞死等,進(jìn)而損傷組織器官的結(jié)構(gòu)和功能。腎臟是鎳主要的儲(chǔ)存和排泄器官,也是鎳攻擊的靶器官之一。氯化鎳(NiCl_2)是自然界中最常見(jiàn)的鎳化合物,也是人和動(dòng)物最常接觸的鎳毒性物質(zhì)。目前,尚未見(jiàn)有NiCl_2致人和動(dòng)物腎臟損傷及其作用機(jī)制的系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用實(shí)驗(yàn)病理學(xué)、生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)、TUNEL、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR等方法,研究日糧NiCl_2對(duì)雛雞腎臟損傷的影響,包括腎臟組織結(jié)構(gòu)與功能損傷、氧化損傷、細(xì)胞周期改變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng),在組織、細(xì)胞和分子水平上探討NiCl_2致腎臟損傷的作用機(jī)理,為基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下:1.NiCl_2對(duì)雛雞腎臟結(jié)構(gòu)、功能和氧化損傷的影響試驗(yàn)選用1日齡艾維因肉雞健雛280只,隨機(jī)分為4組,每組70只,分別飼以對(duì)照日糧和實(shí)驗(yàn)日糧(NiCl_2 300 mg/kg、600 mg/kg和900 mg/kg)42天。試驗(yàn)期間,每天進(jìn)行臨床觀察。試驗(yàn)第14、28和42天,腎臟病理學(xué)觀察結(jié)果表明,日糧NiCl_2 300mg/kg及其以上引起腎臟臟器指數(shù)降低、腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性、空泡變性、壞死和凋亡,腎臟組織結(jié)構(gòu)受損。上述變化呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性。試驗(yàn)14、28和42天,腎臟功能指標(biāo)的生化檢測(cè)結(jié)果顯示,NiCl_2 300mg/kg及其以上時(shí),Na~+/K~+-ATP酶活性、Ca~(2+)-ATP酶活性、LDH酶活性、SDH酶活性和ACP酶活性降低,ALP酶活性升高,腎臟功能降低,與腎臟組織結(jié)構(gòu)受損一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)腎臟Ni含量與腎臟結(jié)構(gòu)、功能受損程度成正比。試驗(yàn)的14、28和42天,應(yīng)用生物化學(xué)和qRT-PCR法檢測(cè)了腎臟氧化損傷指標(biāo)、非酶性和酶性抗氧化指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),NiCl_2 300mg/kg及其以上引起NO、MDA、8-OHdG含量升高,GSH含量和羥自由基抑制能力下降,抗氧化酶(CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、GST、GSH-Px和GR)和總抗氧化(T-AOC)活性降低,以及抗氧化酶(CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、GST、GSH-Px、GR)mRNA表達(dá)水平降低,iNOS酶活性和mRNA表達(dá)量水平升高,腎臟發(fā)生氧化損傷,也是NiCl_2致腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的病理基礎(chǔ)。2.NiCl_2對(duì)雛雞腎臟細(xì)胞周期的影響試驗(yàn)動(dòng)物的分組及管理與1同。試驗(yàn)的14、28和42天,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,NiCl_2300mg/kg及其以上顯著增加腎臟G_2/M期細(xì)胞的百分率,降低G_0/G_1期細(xì)胞的百分率,對(duì)S期無(wú)顯著影響,腎臟細(xì)胞周期受抑于G_2/M期。應(yīng)用qRT-PCR和免疫組化方法測(cè)定了細(xì)胞G_2/M期的調(diào)節(jié)因子,發(fā)現(xiàn)抑制G_2/M期的途徑是ATM介導(dǎo)的p53依賴(lài)途徑和非p53依賴(lài)途徑,p-ATM的蛋白表達(dá)和ATM mRNA表達(dá)水平顯著升高。在p53依賴(lài)途徑中,p53和p21的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平顯著升高。在非p53依賴(lài)途徑中,p-Chk1和p-Chk2的蛋白表達(dá)和Chk1和Chk2的mRNA表達(dá)水平顯著升高,p-cdc25C的蛋白表達(dá)和cdc25mRNA表達(dá)水平顯著降低。同時(shí),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G_2到M期的cdc2、cyclinB和PCNA的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平也顯著降低。結(jié)果表明,NiCl_2通過(guò)ATM-p53-p21和ATM-Chk1/Chk2-cdc25通路抑制腎臟細(xì)胞周期的G_2/M期,腎臟細(xì)胞的增殖和腎臟的生長(zhǎng)發(fā)育受阻。3.NiCl_2對(duì)雛雞腎臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響試驗(yàn)動(dòng)物的分組及管理與1同。試驗(yàn)的14、28和42天,qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),NiCl_2 300mg/kg及其以上時(shí)腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78和GRP94的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平顯著升高,腎臟細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。結(jié)果表明,NiCl_2300mg/kg及其以上時(shí),UPR中的3個(gè)經(jīng)典分支通路被激活:(1)胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)通路:在PERK通路中真核翻譯起始因子2a(eIF2?)、活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)的mRNA表達(dá)顯著升高;(2)需肌醇跨膜激酶/核酸內(nèi)切酶1(IRE1)通路:在IRE1通路中IRE1、XBP1的mRNA表達(dá)顯著升高;(3)活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)通路:在ATF6通路中ATF6的mRNA表達(dá)顯著升高。4.NiCl_2對(duì)雛雞腎臟細(xì)胞凋亡的影響試驗(yàn)動(dòng)物的分組及管理與1同。試驗(yàn)的14、28和42天,流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),NiCl_2 300mg/kg及其以上時(shí)腎臟細(xì)胞的凋亡率明顯增高,并由線粒體介導(dǎo)的凋亡通路、死亡受體Fas介導(dǎo)的凋亡通路和PI3K/Akt抗凋亡通路所誘導(dǎo)。試驗(yàn)的14、28和42天,qRT-PCR和免疫組化測(cè)定結(jié)果顯示,調(diào)節(jié)線粒體膜穩(wěn)定性的Bcl-2家族蛋白失衡,其中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平顯著降低,促凋亡蛋白Bax、Bak的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,線粒體膜電位(MMP)受損,促凋亡蛋白cyt c、AIF、Smac、EndoG、HtrA2、Apaf1、caspase-9、caspase-3、caspase-6、caspase-7、PARP的mRNA表達(dá)水平顯著升高,抗凋亡蛋白XIAP的mRNA表達(dá)水平顯著降低。免疫組化染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn),cyt c、caspase-9、c-caspase-3、c-PARP的蛋白表達(dá)水平顯著升高。上述結(jié)果表明,NiCl_2 300mg/kg及其以上時(shí),腎臟細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的凋亡通路被激活。試驗(yàn)的14、28和42天,qRT-PCR和免疫組化測(cè)定結(jié)果表明,NiCl_2 300mg/kg及其以上引起腎臟Fas、FasL、caspase-8、caspase10、Bid的mRNA表達(dá)水平顯著升高,c-caspase-8和caspase-10的蛋白表達(dá)水平顯著升高,腎臟細(xì)胞死亡受體Fas介導(dǎo)的凋亡通路被激活。試驗(yàn)的14、28和42天,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NiCl_2 300mg/kg及其以上時(shí),腎臟PI3K、Akt1和Akt2的mRNA表達(dá)水平顯著降低,腎臟細(xì)胞PI3K/Akt抗凋亡通路受抑。5.NiCl_2對(duì)雛雞腎臟細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響試驗(yàn)動(dòng)物的分組及管理與1同。試驗(yàn)的14、28和42天,qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),NiCl_2300mg/kg及其以上顯著提高腎臟核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB mRNA表達(dá)和p-NF-κB的蛋白表達(dá)水平,炎癥因子TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的mRNA表達(dá)水平也顯著升高,激活了NF-κB信號(hào)通路,引發(fā)腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)。同時(shí),qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),NiCl_2 300mg/kg及其以上可抑制腎臟抗炎癥因子IL-2、IL-4、IL-13的mRNA表達(dá)水平,促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。上述結(jié)果表明,日糧NiCl_2 300 mg/kg及其以上引發(fā)腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷、功能損傷、氧化損傷、細(xì)胞周期阻滯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。氧化損傷是NiCl_2致腎臟損傷的病理基礎(chǔ),而細(xì)胞周期阻滯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)則是NiCl_2致腎臟損傷的作用途徑。本文首次系統(tǒng)地研究了NiCl_2對(duì)雛雞腎臟結(jié)構(gòu)、功能和氧化損傷、細(xì)胞周期、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響,并從細(xì)胞水平、基因水平和蛋白水平上探討了分子機(jī)理。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S859.8
【部分圖文】：

與細(xì)胞周期胞周期（cell cycle）是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開(kāi)始到下一次有束所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程稱(chēng)為一個(gè)周期。細(xì)胞周期主要包括 G0 期（靜息期）、G1 合成前期）、S 期（DNA 合成期）、G2 期（DNA 合成后期）和 M 期（有絲分 1-1）。正常的細(xì)胞周期對(duì)于維護(hù)器官和組織的發(fā)育有很重要的作用，當(dāng)細(xì)胞停滯時(shí)，組織中細(xì)胞增殖和死亡細(xì)胞的平衡被打破，組織器官就會(huì)發(fā)育不良甚]。而當(dāng)細(xì)胞周期過(guò)快時(shí)就會(huì)引發(fā)細(xì)胞的過(guò)度增殖，繼而引起組織器官的肥大甚細(xì)胞周期是一個(gè)受?chē)?yán)格控制的的進(jìn)程。細(xì)胞出現(xiàn)緊急情況時(shí)，如當(dāng)中心粒或動(dòng)能，染色體斷裂，DNA 損傷等，細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)會(huì)立即停止細(xì)胞周期的進(jìn)程，止于細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期內(nèi)，對(duì)其損傷進(jìn)行修復(fù)，若修復(fù)無(wú)效則使細(xì)胞發(fā)。

錄因子6（ATF6）。正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)3種跨膜蛋白都與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（GRP78）等伴侶分子結(jié)合而處于無(wú)活性狀態(tài)。ERS發(fā)生后，3種跨膜蛋白都將從GRP78等伴侶結(jié)合蛋白上解離出來(lái)，活化PERK、IRE1及ATF6啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄（圖1-2）[58, 90]。（1）PERK通路：PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ⅰ型跨膜蛋白，屬于絲/蘇蛋白激酶，與GRP78解離后，通過(guò)寡聚化并自我磷酸化而激活，活化的PERK磷酸化eIF2α，從而廣泛下調(diào)了

9. 鎳與細(xì)胞凋亡9.1 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡（apoptosis）一詞首先是由 Kerr 等（1972）于 1972 年提出，是指細(xì)一定的生理和病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，通過(guò)激活 DNA 內(nèi)切酶，使細(xì)胞核發(fā)縮，裂解，最后形成凋亡小體，被有吞噬能力的細(xì)胞清除（圖 1-3）[103]。細(xì)胞凋亡體生長(zhǎng)發(fā)育的正常現(xiàn)象，對(duì)于維持多細(xì)胞機(jī)體的完整性、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和自身穩(wěn)有重要作用。當(dāng)細(xì)胞凋亡受到抑制，細(xì)胞逃脫了細(xì)胞輪回的循環(huán)，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)殖而引起腫瘤發(fā)生。相反，當(dāng)細(xì)胞凋亡無(wú)限制性的發(fā)生時(shí)就會(huì)引起細(xì)胞過(guò)度損傷和而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病如帕金森�。≒arkinson）和阿爾茲海默癥（Alzheimer）[104胞的凋亡與抗凋亡處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

【參考文獻(xiàn)】

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1 李勇;孔令青;高洪;嚴(yán)玉霖;;自由基與疾病研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年04期

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1 唐X;氯化鎳對(duì)雛雞胸腺免疫功能影響的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2814286