當前,我國寵物數(shù)量逐年增多,隨之而來的寵物疫病也不斷增加,由此造成了公共衛(wèi)生問題不容樂觀。寵物大腸桿菌病、耶爾森菌病、空腸彎曲菌病等是目前比較常見的人獸共患細菌性傳染病,臨床癥狀主要是嚴重的腹瀉。目前針對這3種寵物細菌性疾病的檢測方法雖然對該病的診斷起到了重要作用,但普遍存在檢測耗時長,步驟繁瑣,假陽性率偏高等問題,這與快速檢測方法“實時”、“快速”的要求相距甚遠。因此,建立一種快速檢測方法對于這3種細菌性疾病的監(jiān)測防控具有重要意義。熒光偏振檢測法(Fluorescence Polarization Immunoassay Assay,FPIA)屬于均相的免疫分析方法,具有簡單、可靠、快速和高效的特點,可滿足高通量、高速度、多殘留和自動化的檢測要求。本研究以熒光素FITC標記產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌和空腸彎曲菌的特異性蛋白,并以標記產(chǎn)物為示蹤物建立一種新型熒光偏振免疫技術,從而達到簡單靈敏且快速的檢測效果。主要研究內(nèi)容和結果如下:1、對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌FaeG基因、小腸結腸炎耶爾森菌ail基因和空腸彎曲菌Peb1A基因進行原核表達,對重組蛋白進行鑒定,證明蛋白具有良好的免疫原性。2、利用熒光素FITC在堿性條件下能與蛋白的胺基發(fā)生結合的特點,將FITC蛋白偶聯(lián)形成示蹤物FITC-FaeG、FITC-ail、FITC-Peb1A,通過熒光光譜鑒定及瓊脂糖凝膠電泳對所形成的示蹤物進行鑒定。3、人工感染新西蘭大白兔制備產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌及空腸彎曲菌全菌多克隆抗體,利用間接ELISA法檢測多克隆抗體效價,分別為1:64000、1:128000和1:102400。4、對示蹤物最佳反應時間、最佳反應濃度及血清最佳稀釋度進行優(yōu)化后,建立產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌和空腸彎曲菌熒光偏振抗體檢測方法,并對本方法各項指標進行評估,結果顯示:(1)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌熒光偏振抗體檢測方法的最低檢測效價為1:80,僅與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌陽性血清發(fā)生特異性反應,但在其他陽性抗血清中無交叉反應,具有高度的特異性;批內(nèi)批間變異系數(shù)為0.43%~3.47%和1.35%~4.68%,變異范圍均小于10%,重復性較好。(2)小腸結腸炎耶爾森菌熒光偏振抗體檢測方法最低檢測效價為1:120,具有較強的特異性;批內(nèi)批間變異系數(shù)為0.69%~3.81%和2.52%~6.47%,變異范圍均小于10%,具有較好的重復性。(3)空腸彎曲菌熒光偏振抗體檢測方法最低檢測效價為1:160,具有較強的特異性;批內(nèi)批間變異系數(shù)為0.69%~3.81%和2.52%~6.47%,變異范圍均小于10%,具有較好的重復性。5、本研究建立的三種抗體檢測方法和相應的市售ELISA試劑盒同時對200份犬的臨床血清樣本進行檢測,結果產(chǎn)腸毒素大腸桿菌總體符合率為95%;小腸結腸炎耶爾森菌總體符合率為93%;空腸彎曲菌總體符合率為89%。綜上所述,本研究通過對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌FaeG基因、小腸結腸炎耶爾森菌ail基因和空腸彎曲菌Peb1A基因的原核表達,以及FITC對其進行標記形成示蹤物,建立了產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森菌和空腸彎曲菌熒光偏振抗體檢測方法。本研究建立的方法具有較好的特異性、靈敏度及重復性,達到簡單、靈敏且快速的檢測效果,可應用于血清中抗體的快速檢測,為寵物3種細菌性疾病的流行病學調查和監(jiān)測提供技術和產(chǎn)品。
【學位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

圖 4-1 熒光偏振檢測原理Fig.4-1 Principle of fluorescence polarization detection光偏振檢測的優(yōu)點和缺點具有與 ELISA 等其他免疫分析方法的相同特點外，F(xiàn)PA 還具有以：. 均相系統(tǒng)，不需要洗滌操作，可大大減少試劑的用量；. 檢測速度很快，且易于自動化，適于快速的篩選檢測；. 熒光標記抗原的均一性好，性質穩(wěn)定，可長期保存，方法的重現(xiàn). FP 值是一個比值，與其他熒光檢測技術相比，不易受溶液顏色和化的影響，結果穩(wěn)定，可靠性高；. 選用不同發(fā)射波長的熒光素來進行多標記檢測，可實現(xiàn)多目標物定量分析。

圖 1-1 FaeG 基因 PCR 擴增結果1 the result of FaeG gene PCR amplificA 分子量標準（DL2000）；1-2 FaeG 基因 PCR Marker (DL2000); 1-2 FaeG gene PCR pr隆森菌基因組為模板擴增 ail 基因，得到測序發(fā)現(xiàn)分別與 GenBank 中 ail 基因序

圖 1-1 FaeG 基因 PCR 擴增結果-1 the result of FaeG gene PCR amplifA 分子量標準（DL2000）；1-2 FaeG 基因 PA Marker (DL2000); 1-2 FaeG gene PCR 隆森菌基因組為模板擴增 ail 基因，得測序發(fā)現(xiàn)分別與 GenBank 中 ail 基因序。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 訾占超;亢文華;馬英;趙柏林;;熒光偏振技術在布魯氏菌病檢測中的應用[J];中國人獸共患病學報;2014年10期

2 楊緒秋;方一臻;張艷艷;范紅結;;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4菌毛抗體間接ELISA檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2014年08期

3 翟海華;王娟;王君偉;蓋文燕;黃秀梅;曲志娜;;空腸彎曲菌的致病性及致病機制研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2013年12期

4 許紫建;楊兵;蘇霞;周宏專;史愛華;徐福洲;;空腸彎曲菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立和優(yōu)化[J];華北農(nóng)學報;2013年03期

5 陸文總;倪原;趙晨;張亮;任郁苗;;TNT熒光偏振免疫檢測方法研究[J];西安工業(yè)大學學報;2013年01期

6 姜柯安;賀志良;宋方洲;馬永平;;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88菌毛蛋白與大腸桿菌不耐熱腸毒素b亞單位的原核表達及其鼻腔免疫效果[J];中國生物制品學雜志;2012年09期

7 李書光;李峰;苗立中;張娜;肖躍強;陳金龍;孫翠平;沈志強;;ETEC K88菌毛蛋白抗體PPA-ELISA檢測方法的建立[J];動物醫(yī)學進展;2012年06期

8 周虹;朱軍;朱國強;;動物源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)黏附素研究進展[J];微生物學報;2012年06期

9 王玉玲;柴銘駿;劉紅梅;;應用熒光偏振檢測方法對出口牛進行布氏桿菌病檢測[J];中國動物檢疫;2012年05期

10 陳西;申果;張舒;吳玉叢;徐曉娟;蔡旭旺;;細胞致死膨脹毒素的結構,功能及應用前景[J];中國預防獸醫(yī)學報;2012年03期

相關博士學位論文 前2條

1 米鐵軍;動物性食品中喹諾酮類藥物殘留的熒光偏振免疫分析研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2013年

2 唐建設;有機磷農(nóng)藥熒光偏振及多殘留免疫分析研究[D];上海交通大學;2008年

相關碩士學位論文 前8條

1 王雪;EHEC O157:H7和空腸彎曲菌氨基磁珠-LAMP檢測方法的建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 王云霄;表面展示STa類毒素的蠟樣芽胞桿菌重組菌株的構建及其對小鼠的免疫原性的測定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 王濤;生鮮豬肉中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

4 姜柯安;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88菌毛蛋白與LTb的原核表達及其鼻腔免疫的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

5 王芳;ETEC腸毒素SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法的建立[D];西北農(nóng)林科技大學;2011年

6 黃瑛;小腸結腸炎耶爾森菌ail和foxA基因的多態(tài)性分析以及real-time PCR檢測方法的建立[D];中國疾病預防控制中心;2010年

7 尹衍新;基于CjaA蛋白檢測雞空腸彎曲菌抗體的間接ELISA方法建立及其單克隆抗體研制[D];揚州大學;2010年

8 王婷;空腸彎曲菌flaA、peb1A基因的克隆表達及單克隆抗體的制備[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2008年

本文編號：2814186