十二指腸賈第蟲(Giardia duodenalis),也稱藍(lán)氏賈第蟲(Giardia lamblia),簡(jiǎn)稱賈第蟲(Giardia),是一種重要的寄生性人獸共患原蟲,由其引起的賈第蟲病被稱為“旅行者腹瀉”,臨床上表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、嘔吐以及嬰幼兒發(fā)育遲緩等癥狀,并可引起膽囊炎及肝臟損壞,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致嬰幼兒和免疫缺陷患者的死亡。美國(guó)已將賈第蟲列入生物恐怖的黑名單,世界范圍內(nèi)城市供水和生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)均把賈第蟲檢測(cè)作為必檢指標(biāo)之一。目前臨床上常用甲硝唑治療賈第蟲病,而甲硝唑?qū)υ袐D和哺乳期的女性毒副作用很大。迄今尚無理想防治賈第蟲的辦法,究其原因就是對(duì)賈第蟲的致病機(jī)制缺乏詳盡的了解,尚未找到藥物或疫苗關(guān)鍵靶位。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是參與機(jī)體先天免疫的一類重要模式識(shí)別受體,能夠識(shí)別病原微生物的保守結(jié)構(gòu)成分,激活機(jī)體的先天免疫應(yīng)答。TLRs能夠識(shí)別多種病原寄生蟲,如弓形蟲、隱孢子蟲、瘧原蟲及錐蟲等,并發(fā)揮重要的抗感染作用。目前為止,關(guān)于賈第蟲激活宿主TLRs的研究較少,TLRs在賈第蟲病致病過程中的作用和機(jī)制尚未闡明。本研究將通過對(duì)賈第蟲病毒對(duì)賈第蟲形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其分子基礎(chǔ)進(jìn)行分析,對(duì)TLRs介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答在賈第蟲致病過程中的作用及機(jī)制進(jìn)行研究,以期闡明宿主抗賈第蟲天然免疫應(yīng)答作用機(jī)制,為賈第蟲病的防治提供理論基礎(chǔ)。TLR2受體介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答在賈第蟲致病過程中的作用及機(jī)制。通過熒光定量方法檢測(cè)賈第蟲對(duì)宿主巨噬細(xì)胞TLR2的激活,結(jié)果表明賈第蟲能夠激活TLR2;通過Western blot和ELISA方法分別檢測(cè)賈第蟲對(duì)宿主巨噬細(xì)胞信號(hào)通路的激活及細(xì)胞因子的分泌,結(jié)果表明,賈第蟲能夠依賴于TLR2激活P38、ERK和AKT信號(hào)通路,并且通過TLR2-AKT信號(hào)通路顯著抑制TNF-α、IL-12p40、IL-6的分泌;通過動(dòng)物試驗(yàn)研究TLR2在賈第蟲感染過程中的作用,結(jié)果表明,賈第蟲感染宿主后能夠通過激活TLR2-AKT信號(hào)通路抑制IL-12 p40等細(xì)胞因子的分泌,使小鼠腸道內(nèi)滋養(yǎng)體增加,腸道病變加重,導(dǎo)致更為嚴(yán)重的賈第蟲病。TLR3受體介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答在賈第蟲致病過程中的作用及機(jī)制。首先,我們用賈第蟲病毒感染無病毒株賈第蟲構(gòu)建了新的VIG蟲株。通過熒光定量方法檢測(cè)不同蟲株賈第蟲對(duì)宿主巨噬細(xì)胞TLR3的激活,結(jié)果表明TLR3能夠識(shí)別攜病毒株和VIG株而不能識(shí)別無病毒株,進(jìn)一步分析表明TLR3能識(shí)別前兩者中的賈第蟲病毒ds RNA;通過ELISA方法檢測(cè)不同蟲株賈第蟲對(duì)宿主巨噬細(xì)胞信號(hào)通路的激活及細(xì)胞因子的分泌,結(jié)果表明,攜病毒株和VIG株通過激活TLR3信號(hào)通路引起的細(xì)胞因子分泌顯著多于無病毒株,進(jìn)一步分析表明,賈第蟲病毒ds RNA也通過激活TLR3信號(hào)通路引起的細(xì)胞因子分泌;通過動(dòng)物試驗(yàn)研究TLR3在不同蟲株賈第蟲感染過程中的作用,結(jié)果表明,攜病毒株和VIG株賈第蟲相對(duì)于無病毒株賈第蟲,感染宿主后能夠通過激活TLR3信號(hào)通路提高TNF-α、IL-6及IL-12 p40的分泌,使小鼠腸道內(nèi)滋養(yǎng)體減少,腸道病變減輕,導(dǎo)致較輕的賈第蟲病。賈第蟲病毒對(duì)賈第蟲形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其分子基礎(chǔ)。通過掃描電鏡和透射電鏡對(duì)病毒感染后滋養(yǎng)體形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察,結(jié)果表明,病毒感染無病毒滋養(yǎng)體出現(xiàn)尾部結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)內(nèi)包含糖原和病毒樣粒子。通過對(duì)不同蟲株滋養(yǎng)體增殖和體外誘導(dǎo)成囊率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明,攜病毒株和VIG株滋養(yǎng)體相對(duì)于無病毒株增殖更快,而誘導(dǎo)成囊率更低。通過RNA-seq方法對(duì)VIG株和無病毒株賈第蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),賈第蟲病毒感染后能夠通過調(diào)控賈第蟲滋養(yǎng)體糖代謝信號(hào)通路影響賈第蟲的增殖和成囊。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)賈第蟲能夠激活宿主TLR2-AKT信號(hào)通路,抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌,導(dǎo)致野生型小鼠較嚴(yán)重的賈第蟲病。攜病毒株和VIG株激活TLR3信號(hào)通路,增加促炎性細(xì)胞因子的分泌,引起野生型小鼠較輕的賈第蟲病。進(jìn)一步研究表明TLR3識(shí)別的分子是賈第蟲病毒ds RNA,而且賈第蟲病毒能夠通過糖代謝通路影響賈第蟲生長(zhǎng)發(fā)育。以上結(jié)果顯示賈第蟲通過激活宿主TLR2逃避免疫攻擊,通過激活宿主TLR3發(fā)揮抗賈第蟲感染作用,從而揭示了賈第蟲致病的新機(jī)制。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4
【部分圖文】：

圖 3.1 文庫(kù)構(gòu)建流程Fig 1.1 The construction process of the library數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析據(jù)預(yù)處理以去除低質(zhì)量區(qū)域和銜接子序列。使用 TopH 賈 第 蟲 轉(zhuǎn) 錄 組 進(jìn) 行 比 對(duì) （ A 型 ， WB 株 ，b.org/Giardiadb/;（38,39））。 HTSeq 計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)出每個(gè)基 R 包中的 edgeR 對(duì)差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行鑒定（標(biāo)準(zhǔn)化為每百萬個(gè)讀數(shù)（RPM）在不同樣品之間進(jìn)行，并且僅保留至少兩個(gè)樣品中具有至少 1RPM 表達(dá)水。將具有以下標(biāo)準(zhǔn)的基因設(shè)定為顯著 DEGs 的閾值： 株的賈第蟲的基因顯示至少兩倍的表達(dá)改變，校正的 p（倍數(shù)變化）| > 1。隨后，使用 GOseq R 軟件包基于富集分析，校正的 p 值閾值設(shè)置為 0.05。生物信息學(xué)

圖 1.2 生物信息學(xué)分析流程Fig 1.2 Bioinformatics analysis process1.2.15 差異基因熒光定量驗(yàn)證為了驗(yàn)證 RNA-seq 分析得到的差異基因結(jié)果，我們使用與 RNA 測(cè)序相同的 RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄后，隨機(jī)挑選了（GL50803_101589），葡萄糖-6-磷酸 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GL50803_14259），VSP（GL50803_115742），組織蛋白酶 L 前體（GL50803_9548），NADP 特異性谷氨酸脫氫酶（GL50803_21942），假定 RNA解旋酶（GL50803_6616），ATP 依賴性 RNA 解旋酶樣蛋白（GL50803_15048），假定蛋白（GL50803_17354），核仁蛋白 NOP2（GL50803_16948）和鞭毛相關(guān)蛋白（GL50803_41512）等 10 個(gè) RNA-Seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行 qRT-PCR 分析驗(yàn)證。所有用于qRT-PCR的引物均使用Primer 6軟件設(shè)計(jì)并由Sangon Biotech（中國(guó)上海）合成。所有熒光定量使用的引物如下：

圖 1.3 賈第蟲滋養(yǎng)體A,B,C 分別代表賈第蟲攜病毒株、無病毒株以及 VIG 株滋養(yǎng)體Fig 1.3 Giardia trophozoites,C represents GLV-containing、GLV-free、VIG(GLV-infected Giardia) Giardstrain, respectively 攜病毒、無病毒以及 VIG 株賈第蟲滋養(yǎng)體總 RNA 提取驗(yàn)證將提取的各蟲株滋養(yǎng)體總 RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以驗(yàn)證蟲株的準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)，無病毒株賈第蟲滋養(yǎng)體總 RNA 只有 3 條核糖體 RNA 帶，而攜病新構(gòu)建的 VIG（即 GLV-infected Giardia）蟲株均含有 4 條帶，且二者最帶均為 6.3kb 左右，與已報(bào)道的賈第蟲病毒條帶大小吻合，得到的 VIG 穩(wěn)定攜帶賈第蟲病毒。RNA 在 260/280 的吸收值比在 1.80-2.00 之間，說的總 RNA 質(zhì)量良好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖 1.4。15000M 1 2 3

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本文編號(hào)：2814390