新城疫(Newcastle Disease,ND)是一種急性、烈性呼吸道傳染病,是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引發(fā)的禽類疫病,嚴(yán)重威脅了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展,已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須通報(bào)的疫病。NDV是具有囊膜包裹的單股負(fù)鏈RNA病毒,其基因組能編碼六個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。其中,核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)是NDV基因組中表達(dá)量最多的結(jié)構(gòu)蛋白。NP蛋白與磷蛋白(phosphate protein,P)、大分子聚合酶蛋白(large protein,L)和病毒核酸共同形成病毒復(fù)制的基本單元,核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein complex;RNP)。NP蛋白還具備影響病毒毒力、介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和引發(fā)自噬等功能。這些信息表明NP是一個(gè)多功能蛋白。然而,目前關(guān)于NP蛋白是通過(guò)哪些宿主蛋白發(fā)揮作用的尚無(wú)相關(guān)報(bào)道,為了揭示NP蛋白發(fā)揮相關(guān)功能的分子機(jī)制,本文主要從以下四個(gè)方面展開(kāi)研究:(1)為了驗(yàn)證NP蛋白對(duì)NDV復(fù)制的影響,構(gòu)建了NP的真核表達(dá)載體,并驗(yàn)證其能在DF-1細(xì)胞中正常表達(dá)。然后在DF-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NP蛋白,通過(guò)Q-PCR、蝕斑和Western blot的方法檢測(cè)病毒含量,結(jié)果表明在DF-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NP蛋白能夠促進(jìn)病毒復(fù)制。為進(jìn)一步研究NP蛋白促進(jìn)病毒復(fù)制的機(jī)制,通過(guò)Q-PCR檢測(cè)干擾素IFNα、IFNβ、IFNγ的表達(dá)量,表明NP蛋白能抑制干擾素的表達(dá)。這些結(jié)果說(shuō)明NDV的NP蛋白可能通過(guò)拮抗干擾素,從而促進(jìn)病毒復(fù)制。(2)為了探究NP蛋白與哪些宿主因子互作調(diào)控病毒的復(fù)制,將NP基因克隆至pGBKT7載體上,經(jīng)過(guò)自激活驗(yàn)證和毒性檢測(cè)合格后,以pGBKT7-NP為誘餌篩選雞胚成纖維細(xì)胞cDNA酵母文庫(kù),最終獲得包含PIAS4(Protein inhibitor of activated STAT4)和PSMA7(Proteasome subunit alpha type 7)等共20個(gè)與NP蛋白相關(guān)的宿主蛋白。(3)為了探索PIAS4與NP蛋白的關(guān)系,在DF-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NP蛋白,通過(guò)Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NP蛋白可抑制內(nèi)源性PIAS4的表達(dá)。然后在DF-1細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)PIAS4和用siRNA敲低內(nèi)源性PIAS4,通過(guò)Q-PCR、蝕斑和Western blot的方法檢測(cè)病毒含量,結(jié)果表明在DF-1細(xì)胞中PIAS4能夠抑制病毒復(fù)制。為進(jìn)一步研究PIAS4發(fā)揮抗病毒功能的機(jī)制,通過(guò)VSV感染實(shí)驗(yàn)和Q-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)PIAS4后細(xì)胞上清或細(xì)胞中干擾素的含量,發(fā)現(xiàn)PIAS4可能通過(guò)促進(jìn)干擾素的表達(dá)從而抑制病毒復(fù)制。(4)為了驗(yàn)證PSMA7的作用,構(gòu)建了PSMA7的真核表達(dá)載體,并驗(yàn)證其能在DF-1細(xì)胞中正常表達(dá)。然后,在DF-1細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)PSMA7和用siRNA敲低內(nèi)源性PSMA7,通過(guò)Q-PCR、蝕斑和Western blot的方法檢測(cè)病毒含量,結(jié)果表明在DF-1細(xì)胞中PSMA7能夠抑制病毒復(fù)制,而且在DF-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NP蛋白會(huì)抑制內(nèi)源性PSMA7的表達(dá)量。然而通過(guò)VSV感染實(shí)驗(yàn)和Q-PCR檢測(cè)干擾素含量的結(jié)果表明PSMA7不通過(guò)干擾素信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒功能。綜上所述,NDV的NP蛋白能通過(guò)與PIAS4和PSMA7這兩個(gè)宿主蛋白互作,并下調(diào)這兩個(gè)蛋白的表達(dá),促進(jìn)病毒的復(fù)制。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

物學(xué)特征 RNA 病毒，在分類學(xué)上屬于副粘病毒科）(Cox et al. 2017)。目前關(guān)于 NDV 基因nt 和 15198nt(Alíz Czeglédi et al. 2006；Lurthy et al. 1998；Buchholz et al. 1999)。NP-P-M-F-HN-L-Trailer-5’），共編碼 6 個(gè)protein, NP）、融合蛋白（fusion protein, 蛋 白 （ matrix protein, M ）、 血 凝 素aminidase protein, HN）、大分子聚合酶蛋其中，P 基因轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)發(fā)生編輯，分別在碼突變，分別編碼出V和W兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋株都滿足“六堿基原則”，即當(dāng)病毒復(fù)制時(shí)毒完成高效復(fù)制(Calain et al. 1993)。

圖 1-2 酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白互作的原理(段強(qiáng)德 2009Figure 1-2 Detection of protein interactions by yeast two hybrid sy雜交技術(shù)在 NDV 中的研究概況技術(shù)在研究病毒與宿主之間的關(guān)系方面，具有重大意義研究中，已經(jīng)有許多利用酵母雙雜交技術(shù)的報(bào)道。在宿以 NDV M 蛋白為誘餌，利用該技術(shù)篩選得到與 NDV 次揭示了 M 蛋白的入核機(jī)制(Duan et al. 2018)。還有研 11 種副粘病毒 V 蛋白 C 端能與 MDA-5 互作，這為副基礎(chǔ)(Childs et al. 2007)。胡湘云以 NDV F 蛋白為誘餌庫(kù)，得到了能和 F 蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)的納米抗體(胡抗 HN 的納米抗體，得到了有抑制病毒復(fù)制作用的納構(gòu)建了雞胚成纖維細(xì)胞 cDNA 酵母文庫(kù)(褚志禮 2018)，酵母雙雜交技術(shù)篩選該文庫(kù)，得到了與 V 蛋白互作的能的研究，其中 TXNL1 和 CacyBP 能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡l. 2018；Chu et al. 2018)。

圖 2-1 NP 真核表達(dá)載體的構(gòu)建A，擴(kuò)增得到 1470 bp 的 NP 基因；B，菌液 PCR 驗(yàn)證；C，酶切驗(yàn)證構(gòu)建的質(zhì)粒Figure 2-1 Construction of NP eukaryotic expression plasmide 1470 bp NP gene was obtained by RT-PCR amplification; B, Results of PCR based on tranbacteria; C, The identification of plasmid digested with EcoRI and XholI.2 NP 真核表達(dá)載體的表達(dá)將構(gòu)建成功的 pCAGEN-Flag-NP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 DF-1 細(xì)胞，24 h 后收取蛋白樣 Western blot 檢測(cè) NP 蛋白的表達(dá)情況（圖 2-2），結(jié)果表明 NP 蛋白能在 DF-常表達(dá)。圖 2-2 NP 蛋白在 DF-1 細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2-2 Detection of NP protein expression in DF-1 cells

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本文編號(hào)：2813958