牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染牛表現(xiàn)出一種復(fù)雜,多種臨床表現(xiàn)的疾病,主要為腹瀉、急性及慢性黏膜病、先天性缺陷、免疫抑制、免疫耐受、持續(xù)性感染、母畜流產(chǎn),死胎和畸形胎等[1],該傳染病嚴(yán)重影響了世界養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。隨著規(guī)�；B(yǎng)殖和種畜的頻繁調(diào)運(yùn),該病在我國流行趨勢也逐漸上升,給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。本研究利用從內(nèi)蒙古周邊某些牧場采集的鼻拭子樣本和血液樣本,樣本經(jīng)處理后,分別接種已長成單層的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)瓶,用已設(shè)計(jì)好的引物PCR鑒定為陽性后分離出牛病毒性腹瀉病毒,利用純化后的病毒進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。首先我們分析了牛病毒性腹瀉病毒(BVDV-1)E2蛋白的主要編碼區(qū),利用PCR擴(kuò)增技術(shù)將BVDV-1 E2基因定向克隆到表達(dá)載體Pcold-TF上,將Pcold-TF-E2轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21中,使用IPTG進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)的條件為0.8 mMol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h。收集菌液,經(jīng)過超聲破碎裂解后,利用Ni-IDA蛋白純化試劑盒純化后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定,表達(dá)的重組蛋白E2鑒定大小為82 Kda,與預(yù)期條帶相符。使用裂解表達(dá)、純化后的產(chǎn)物E2蛋白,作為包被抗原,建立了用于檢測牛病毒性腹瀉病毒的間接ELISA方法。確定反應(yīng)的最佳條件為:抗原包被濃度為8 ug/mL,最佳包被溫度和時(shí)間為4℃ 16 h,一抗血清稀釋比為1:100,反應(yīng)溫度和時(shí)間為37℃1 h,最佳封閉液為10%PEG4000,37℃封閉1 h,酶標(biāo)二抗的稀釋度為1:6000,反應(yīng)溫度和時(shí)間為37℃1h。通過試驗(yàn)確定陰陽判定的臨界值為0.33。該方法與牛傳染性鼻氣管炎、牛傳染性胸膜肺炎、赤羽病、副結(jié)核、布魯菌病,小反芻獸疫等陽性血清均無交叉反應(yīng),說明該方法具有良好的特異性,將BVDV的陽性血清稀釋至1:4096時(shí)仍可判斷為陽性,表明所建立的方法具有較高的敏感性,組間和組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于5%,表明該方法具有較好的重復(fù)性。采用以上建立的間接ELISA方法和通過IDEXX BVDV抗體檢測試劑盒檢測189份血清臨床樣品,兩者的符合率為92.8%。由以上結(jié)果可知,本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法可以為該病的快速診斷,以及流行病學(xué)調(diào)查等提供便捷有力的手段,且價(jià)格成本低廉。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

２．３結(jié)果逡逑２．３．邋１病毒的X椫沖義嫌茫停模攏訟赴又質(zhì)笛槭曳擲氳模攏鄭模鄭峁繽跡彼盡＃廖Ｎ錘腥靜《鏡膩義希停模攏訟赴�。仾接种病肚G保插澹韜笙赴翁�，可见细胞部窚落，局部愉\張莩魷幀＃緬義銜又植《荊保跺澹櫳翁�，可见细胞拉丝、圃u�。Ｄ为病毒接粥嵅４邋ｍw蟮南赴鶘�，空辶x習(xí)咴齠�，细胞脱落熏F(xiàn)�。辶x希鈴危洛義希海眤i：：：：：：．．逡逑￣邋Ｉ…逡逑４邋你ｋ邋汴ｙ：邐｜邐Ｖ邐＾邐．１逡逑Ｃ邐Ｄ逡逑圖１細(xì)胞病變圖逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｌｅｓｉｏｎ逡逑

邐內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文邐１３＿逡逑２．邋３．邋４間接免疫滅光試驗(yàn)結(jié)果邋？逡逑Ａ為未接種病毒的間接免疫熒光圖，Ｂ為細(xì)胞接種的未稀釋過的ＢＶＤＶ病毒液間接逡逑免疫熒光結(jié)果圖，Ｃ為用ＤＭＥＭ以１：１０稀釋的病毒液接種細(xì)胞的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)逡逑果，Ｄ為１：１００稀釋的病毒液接種細(xì)胞的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果，Ｅ為１：邋２００稀釋的逡逑病毒液接種細(xì)胞的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果。逡逑

圖６邋ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

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本文編號：2813952