牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染牛表現(xiàn)出一種復雜,多種臨床表現(xiàn)的疾病,主要為腹瀉、急性及慢性黏膜病、先天性缺陷、免疫抑制、免疫耐受、持續(xù)性感染、母畜流產,死胎和畸形胎等[1],該傳染病嚴重影響了世界養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。隨著規(guī)�；B(yǎng)殖和種畜的頻繁調運,該病在我國流行趨勢也逐漸上升,給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經濟損失[2]。本研究利用從內蒙古周邊某些牧場采集的鼻拭子樣本和血液樣本,樣本經處理后,分別接種已長成單層的MDBK細胞培養(yǎng)瓶,用已設計好的引物PCR鑒定為陽性后分離出牛病毒性腹瀉病毒,利用純化后的病毒進行后續(xù)的試驗。首先我們分析了牛病毒性腹瀉病毒(BVDV-1)E2蛋白的主要編碼區(qū),利用PCR擴增技術將BVDV-1 E2基因定向克隆到表達載體Pcold-TF上,將Pcold-TF-E2轉化至感受態(tài)細胞BL21中,使用IPTG進行重組蛋白的誘導表達,誘導表達的條件為0.8 mMol/L IPTG 37℃誘導4 h。收集菌液,經過超聲破碎裂解后,利用Ni-IDA蛋白純化試劑盒純化后進行SDS-PAGE和Western blot鑒定,表達的重組蛋白E2鑒定大小為82 Kda,與預期條帶相符。使用裂解表達、純化后的產物E2蛋白,作為包被抗原,建立了用于檢測牛病毒性腹瀉病毒的間接ELISA方法。確定反應的最佳條件為:抗原包被濃度為8 ug/mL,最佳包被溫度和時間為4℃ 16 h,一抗血清稀釋比為1:100,反應溫度和時間為37℃1 h,最佳封閉液為10%PEG4000,37℃封閉1 h,酶標二抗的稀釋度為1:6000,反應溫度和時間為37℃1h。通過試驗確定陰陽判定的臨界值為0.33。該方法與牛傳染性鼻氣管炎、牛傳染性胸膜肺炎、赤羽病、副結核、布魯菌病,小反芻獸疫等陽性血清均無交叉反應,說明該方法具有良好的特異性,將BVDV的陽性血清稀釋至1:4096時仍可判斷為陽性,表明所建立的方法具有較高的敏感性,組間和組內重復試驗變異系數(shù)均小于5%,表明該方法具有較好的重復性。采用以上建立的間接ELISA方法和通過IDEXX BVDV抗體檢測試劑盒檢測189份血清臨床樣品,兩者的符合率為92.8%。由以上結果可知,本試驗建立的間接ELISA方法可以為該病的快速診斷,以及流行病學調查等提供便捷有力的手段,且價格成本低廉。
【學位單位】：內蒙古農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S858.23
【部分圖文】：

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邐內蒙古農業(yè)大學碩士學位論文邐１３＿逡逑２．邋３．邋４間接免疫滅光試驗結果邋？逡逑Ａ為未接種病毒的間接免疫熒光圖，Ｂ為細胞接種的未稀釋過的ＢＶＤＶ病毒液間接逡逑免疫熒光結果圖，Ｃ為用ＤＭＥＭ以１：１０稀釋的病毒液接種細胞的間接免疫熒光試驗結逡逑果，Ｄ為１：１００稀釋的病毒液接種細胞的間接免疫熒光試驗結果，Ｅ為１：邋２００稀釋的逡逑病毒液接種細胞的間接免疫熒光試驗結果。逡逑

圖６邋ＰＣＲ擴增結果逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2813952