結(jié)核病是一種人畜共患的慢性傳染病,對人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展均造成重大威脅。結(jié)核分支桿菌是結(jié)核病的致病菌,它能夠成功地寄宿在宿主巨噬細(xì)胞中,一方面宿主啟動免疫反應(yīng)抑制病原體的增殖和擴散,另一方面結(jié)核分支桿菌進化各種策略逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。為了抵抗這一致病菌的感染,充分了解宿主與病原體相互作用過程的分子機制是至關(guān)重要的。感染過程中,細(xì)胞凋亡、自噬、炎性反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在內(nèi)在聯(lián)系,且均可影響細(xì)胞命運和結(jié)核分支桿菌在宿主體內(nèi)的存活。已有研究表明BCL相關(guān)抗死亡基因2(BAG2)與細(xì)胞在不同病理條件下的命運決定有關(guān),然而,BAG2在結(jié)核分支桿菌感染過程中發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究以小鼠原代巨噬細(xì)胞BMDMs、巨噬細(xì)胞系RAW264.7和J744A.1為靶細(xì)胞,主要探討結(jié)核分支桿菌誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,BAG2在巨噬細(xì)胞中的作用以及其分子機制,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.研究在結(jié)核分支桿菌感染誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中,BAG2表達(dá)變化及調(diào)控其變化的機制。首先,通過定量PCR和免疫印跡,研究結(jié)核分支桿菌感染巨噬細(xì)胞后對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響以及BAG2表達(dá)的動態(tài)變化,結(jié)果證實結(jié)核分支桿菌感染巨噬細(xì)胞后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白HSPA5和CHOP表達(dá)增加,激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時,本研究結(jié)果表明巨噬細(xì)胞無論在結(jié)核分支桿菌強毒株H37Rv還是弱毒株H37Ra刺激下,BAG2均以時間依賴方式表達(dá)下調(diào)。之后,通過雙熒光素酶報告和染色質(zhì)免疫共沉淀,研究在感染條件下Bag2啟動子核心區(qū)域及未折疊蛋白反應(yīng)中ERN1-XBP1信號通路對BAG2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾Ern1或Xbp1抑制感染對BAG2表達(dá)影響,恢復(fù)BAG2的表達(dá),XBP1結(jié)合在Bag2啟動子上,抑制其轉(zhuǎn)錄。2.研究BAG2在結(jié)核分支桿菌感染過程中的功能。首先,通過流式細(xì)胞術(shù)和CFU計數(shù),研究結(jié)核分支桿菌感染巨噬細(xì)胞后干擾或過表達(dá)BAG2對細(xì)胞和結(jié)核分支桿菌存活的影響。結(jié)果顯示干擾Bag2增加細(xì)胞凋亡率,抑制細(xì)胞活性,從而減少細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌的存活。然后,通過免疫印跡、免疫熒光和透射電子顯微鏡,研究結(jié)核分支桿菌感染巨噬細(xì)胞后沉默或過表達(dá)Bag2對細(xì)胞自噬影響以及其是否通過自噬影響細(xì)胞存活。結(jié)果證明BAG2增加自噬標(biāo)記蛋白LC3-II表達(dá)和LC3自噬體形成,促進自噬流,并且激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬,表現(xiàn)為自噬體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位增加。隨后,利用自噬抑制劑抑制自噬早期或晚期,結(jié)果表明在感染條件下抑制自噬增加細(xì)胞凋亡。加入自噬抑制劑Baf A1阻礙BAG2對細(xì)胞保護作用,細(xì)胞活性降低。3.研究BAG2激活細(xì)胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的作用機制。通過免疫共沉淀和免疫印跡,研究干擾Bag2對BCL2和BECN1相互作用的影響。結(jié)果顯示干擾Bag2抑制ERK1/2和BCL2磷酸化,抑制結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的BCL2和BECN1解離。同樣地,加入ERK抑制劑U0126阻斷BAG2對自噬的影響,表明BAG2通過ERK信號通路磷酸化BCL2,促進BECN1解離,激活自噬。之后,通過免疫熒光和免疫共沉淀研究BAG2與自噬受體蛋白SQSTM1相互作用對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的影響。研究結(jié)果證明BAG2與SQSTM1相互作用依賴PB1和UBA結(jié)構(gòu)域。過表達(dá)BAG2顯著增加SQSTM1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位,促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬。4.研究miR-27b/BAG2對炎性反應(yīng)的影響。通過定量PCR和雙熒光素酶報告,研究在結(jié)核分支桿菌感染過程中miR-27b動態(tài)變化及調(diào)控其變化的機制。研究證實巨噬細(xì)胞無論感染強毒株H37Rv還是弱毒株H37Ra,miR-27b表達(dá)均逐漸增加。感染后TLR2/MyD88/NF-κB信號通路被激活,促進miR-27b轉(zhuǎn)錄。其后,通過雙熒光素酶報告和免疫印跡,結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測和驗證Bag2是miR-27b功能性靶基因。結(jié)果證明miR-27b直接靶向Bag2 3'UTR,抑制內(nèi)源性BAG2表達(dá)。本研究進一步探索miR-27b/BAG2對炎性因子的影響及作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-27b抑制NF-κB p65激活從而抑制炎性因子的產(chǎn)生,而BAG2激活NF-κB活性。功能挽救實驗證明BAG2減弱miR-27b對炎性因子的抑制作用,表明miR-27b/BAG2通過調(diào)控NF-κB活性影響炎性因子表達(dá)�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,揭示了BAG2在結(jié)核分支桿菌感染巨噬細(xì)胞中的功能和作用機制,一方面BAG2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,通過細(xì)胞凋亡和自噬在調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和結(jié)核桿菌存活中發(fā)揮重要作用,另一方面BAG2參與miR-27b對炎性反應(yīng)的調(diào)控,避免過度炎性反應(yīng),以平衡感染和組織損傷。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.618
【部分圖文】：

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文PI3P，這可能為隔離膜形成提供了平臺(Matsunaga et al. 2010; Hamasaki et al. 2013)。Beclin1 是自噬信號的整合因子。在 mTOR 被抑制時，ULK1 直接磷酸化 Beclin1，并激活 hVPS3(Russell et al. 2013)。在缺氧和感染過程中，BECN1 從 BCL2 的自噬抑制復(fù)合物中解離出來，BCL2 能刺激 hVPS34 活性(Levine and Deretic 2007)。

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文白質(zhì)的合成，它也磷酸化氧化還原代謝的轉(zhuǎn)錄因子 NRF2（nuclear factor erylated factor 2）(Cullinan et al. 2003)。磷酸化的 eIF2α 促進活化轉(zhuǎn)錄因子 4（actiscription factor 4，ATF4）mRNA 的翻譯，ATF4 編碼下游的轉(zhuǎn)錄因子，控制參凋亡、氨基酸代謝及抗氧化反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄(Avivar-Valderas et al. 2011; B'C013a; Walter et al. 2015)。正常情況下，ATF6 以無活性的堿性亮氨酸拉鏈（ine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子形式存在于細(xì)胞質(zhì)。應(yīng)激條件下，ATF6 與 coat pCOPII）復(fù)合物相互作用，轉(zhuǎn)移至高爾基體，被 site 1 蛋白酶（S1P）和 S2P 胞漿結(jié)構(gòu)域（ATF6f）(Haze et al. 1999)。ATF6f 促進編碼 ERAD 組分的基因和 (Yamamoto et al. 2007)。

圖 2-1 結(jié)核桿菌感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Figure 2-1 M. tuberculosis infection induces ER stress核分支桿菌強毒株（H37Rv）（A）和弱毒株（H37Ra）（B）分別按照圖示時間點處理 RAW2 BMDM 細(xì)胞，免疫印跡檢測 HSPA5 和 CHOP 蛋白表達(dá)。W264.7 cells and BMDMs were infected with M. tuberculosis H37Rv (A) and H37Ra (B) foicated times. Expression levels of HSPA5, CHOP and GAPDH were determined by western blot.2.2 感染條件下 BAG2 表達(dá)情況確定結(jié)核分支桿菌可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，檢測結(jié)核分支桿菌誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)件下 BAG2 的表達(dá)變化。利用 H37Rv 和 H37Ra 感染 RAW264.7 和 BMDM 細(xì)胞印跡（圖 2-2A）和定量 PCR（圖 2-2B）檢測 BAG2 表達(dá)。定量 PCR 和免疫印跡果均表明結(jié)核分支桿菌抑制 BAG2 的表達(dá)。此外，本研究還利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素（Tunicamycin，TM）和毒胡蘿（Thapsigargin，TG）處理巨噬細(xì)胞。如圖 2-3A，HSPA5 和 CHOP 表達(dá)增加，內(nèi)

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本文編號：2813428